葛根素减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤

粟 凤，林安晓，乔东方，丁 菁，陆德琴

(贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳 550004)



葛根素减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤

粟 凤，林安晓，乔东方，丁 菁，陆德琴*

(贵阳医学院 病理生理学教研室， 贵州 贵阳 550004)

葛根素(puerarin, PUE)注射液对心肌缺血-再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, I/R)具有保护作用[1]，但其作用机制尚不完全清楚。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)功能障碍已被认为是心血管疾病发病中的一个重要环节。PUE的心肌保护作用机制是否与eNOS有关？本实验拟采用大鼠心肌I/R损伤模型，探索PUE的心肌保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂： 清洁级雄性SD大鼠54只，体质量200～250 g[贵阳医学院实验动物中心提供，动物合格证序号为SCXK(渝)2011- 0005]。PUE注射液(湖北天药药业有限公司)。NO检测试剂盒(Calbiochem公司)；兔抗eNOS Ser1177抗体、兔抗eNOS Ser633抗体(Millipore公司)；兔抗β-tubulin抗体、兔抗eNOS抗体及HPR标记的羊抗兔的二抗(Santa Cruz公司)；TTC(Solarbio公司)；CK-MB和cTnI检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及处理，大鼠随机分为3组。1)假手术(sham)组；2)I/R组：参照文献[2]复制心肌I/R模型，结扎LAD 45 min后放松结扎线120 min；3)PUE组：结扎LAD前15 min经左颈静脉注射PUE(2.5 mL/kg，浓度40 g/L)，其余操作同I/R组。

1.2.2 左室血流动力学指标测定，采用BL-420E生物机能实验系统(成都泰盟公司)测定左室血流动力学，记录缺血前、缺血45 min及再灌注120 min时左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)及左心室内压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)。

1.2.3 心肌梗死面积测定，TTC法测定心肌缺血和梗死面积。以缺血区心肌重量与左室重量之百分比表示缺血面积，以梗死区心肌重量与缺血区心肌重量之百分比表示梗死面积。

1.2.4 血浆CK-MB及cTnI测定，再灌注结束后，经颈动脉取血5 mL，3 000 r/min离心20 min分离血浆，严格按照ELISA试剂盒说明书测定血浆CK-MB及cTnI。

1.2.5 缺血区心肌组织eNOS蛋白及磷酸化检测，采用蛋白印迹法进行检测。用Bio-Rad凝胶图像分析软件分析蛋白条带相对积分吸光度值。

1.2.6 缺血区心脏组织NO含量测定，严格按照试剂盒说明书测定组织中NO2-/NO3-的含量。

2 结果

2.1 左室血流动力学指标：与sham组比较，I/R组各时间点LVSP、±dp/dtmax下降，LVEDP升高(P<0.05)。与I/R组比较，PUE组各时间点LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP降低(P<0.05)。

2.2 心肌梗死面积：与I/R组比较，PUE组心肌梗死面积明显减小(P<0.05)(表1)。

表1 各组心肌缺血区面积及梗死面积的比较

groupischemiasizeinfarctsizesham00I/R47.04±1.6342.19±2.55PUE45.26±2.9527.12±3.38*

*P<0.05 compared with I/R group.

2.3 血浆CK-MB活力和cTnI浓度：与sham组比较，I/R组血浆CK-MB活力及cTnI浓度明显升高(P<0.05)，PUE处理后血浆CK-MB活力及cTnI浓度明显降低(P<0.05)(表2)。

表2 血浆CK-MB活力和cTnI浓度

groupCK-MBactivity(U/mL)cTnIlevels(ng/mL)sham27.27±0.817.30±0.94I/R40.60±2.04*20.55±1.79*PUE30.18±1.14*#11.83±1.16*#

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group.

2.4 缺血区心脏组织eNOS蛋白及eNOS Ser1177和Ser633的磷酸化水平：与sham组、I/R组比较，PUE组eNOS Ser1177及Ser633的磷酸化水平显著增高(P<0.05)(图1)。

2.5 缺血区心脏组织NO含量：I/R组与sham组间NO含量无明显差异，经PUE处理后NO含量明显增高(P<0.05)(表3)。

表3 缺血区心脏组织NO2-/NO3-含量

groupNO2-/NO3-(mol/gprotein)sham 1.13±0.15I/R 1.14±0.12PUE 1.48±0.32*#

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group.

3 讨论

大量研究表明PUE对心肌I/R损伤具有保护作用[1]，笔者也曾发现PUE能明显减轻大鼠心肌I/R损伤，但其作用机制尚不清楚。PUE明显减小心肌梗死面积，并提高血清NO水平[3]。已经公认eNOS及其产生的NO具有明显心肌保护作用。而eNOS Ser1179/1177及Ser635/633磷酸化可显著上调eNOS的活性，使NO生成增多[4]。本文表明PUE对缺血区心肌组织eNOS总蛋白表达无明显影响，但eNOS Ser1177及Ser633水平均明显升高，导致酶活性增加及NO生成增多，明显改善了I/R损伤心肌的舒缩功能、减少梗死面积、减轻损伤，具有保护效应。本研究提示PUE的心肌保护机制可能与其上调eNOS Ser1177及Ser633磷酸化水平有关。

*P<0.05 compared with sham group；#P<0.05 compared with I/R group图1 各组缺血区心脏组织eNOS总蛋白及eNOS(Ser1177和Ser633)磷酸化水平Fig 1 The levels of eNOS total protein and p-eNOS (Ser1177 and Ser633)in ischemia area of heart tissue in each group

[1] 周玉娟, 魏继承. 葛根素对心肌缺血-再灌注损伤的保护机制及其临床应用[J]. 时珍国医国药, 2008, 5: 1259- 1260.

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[3] 李军, 黄可欣, 王元春. 葛根素对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌酶的影响[J]. 中国实验诊断学, 2013, 17: 244- 246.

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2014- 11- 14

2015- 03- 23

贵州省社会发展攻关项目[黔科合SY字(2013)3019号]

1001-6325(2015)06-0836-02

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