过表达LATS1降低食管癌Eca109细胞增殖

罗 骏，王聪懿，熊 伟，张 诚，吴庆琛

(重庆医科大学附属第一医院 胸心外科, 重庆 400010)



研究论文

过表达LATS1降低食管癌Eca109细胞增殖

罗 骏，王聪懿，熊 伟，张 诚，吴庆琛*

(重庆医科大学附属第一医院 胸心外科, 重庆 400010)

目的运用慢病毒转染技术在食管癌Eca109细胞中过表达LATS1基因，探究LATS1调控Eca109细胞增殖、凋亡及周期的作用及机制。方法构建LATS1基因的慢病毒载体转染Eca109细胞系，RT-PCR检测细胞中LATS1 mRNA的表达；Western blot检测LATS1、YAP、BAX/BCL-2的蛋白表达水平；MTS检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡及周期；hochest33258观察细胞凋亡染色。结果LATS1慢病毒载体转染Eca109细胞后，目的基因组(Ad-LATS1)LATS1 mRNA及LATS1蛋白表达、BAX蛋白表达明显高于对照组(CON)及阴性对照组(Ad-GFP)，而YAP、BCL-2的蛋白表达明显低于对照组及Ad-GFP组(P<0.05)；Ad-LATS1组Eca109细胞的增殖率从第5天开始明显低于对照组及Ad-GFP组(P<0.05)；Ad-LATS1组细胞较Ad-GFP及对照组G1期比例明显增高而S期比例明显缩短，凋亡率明显增高(P<0.05)，细胞荧光染色强度及范围也增高。结论LATS1基因可上调BAX、下调YAP、BCL-2使Eca109凋亡，并诱导G1期延长、S期缩短来降低其增殖力。

食管肿瘤；LATS1；YAP；增殖；凋亡

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球范围内是导致患者病死率第6位的肿瘤[1]，但因其病因和发病机制尚不明确，一直以来都是研究的难点和热点。HIPPO信号通路由LATS1(large tumor suppressor gene 1)、YAP(Yes-associated protein)等因子组成,本研究意在构建LATS1慢病毒载体，在食管鳞癌Eca109细胞中过表达LATS1，探讨其对Eca109细胞增殖、凋亡的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Hoechest 33258(碧云天研究所)，四甲基偶氮唑盐(MTS) (Promega公司)；LATS1、GAPDH引物(上海生工)；兔抗人LATS1多克隆抗体(Abnova公司)；兔抗人YAP多克隆抗体(Santa Cruz公司)；兔抗人BCL-2、BAX和β-actin (Bioword公司)；HRP标记山羊抗兔IgG、PMSF、 SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天研究所)；ECL发光试剂盒(Thermo Scientific公司)。LATS1过表达慢病毒载体(上海吉凯基因构建)；Premix Taq(TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒的转染及实验分组：Eca109细胞复苏后，用含10%胎牛血清的1640，置 37 ℃、5% CO2下培养，以MAI(病毒总数/转染细胞总数)值0、10、20、30、40和50分别加入空载体慢病毒。转染后将Eca109细胞分为3组: CON组(未进行处理的Eca109细胞);Ad-GFP组(用空白病毒转染的Eca109细胞);Ad-LATS1组(用过表达LATS1慢病毒载体转染的Eca109细胞)。

1.2.2 RT-PCR检测各组细胞LATS1的mRNA表达：取对数增殖期Eca109细胞以每孔105个接种于6孔板的3孔并标记，分组处理后，分别收集各组细胞120 h的总RNA，反转录制备 cDNA后扩增、电泳。利用Gene Tools软件进行吸光度值分析。

1.2.3 Western blot检测各组细胞LATS1、YAP、 BAX及BCL-2蛋白的表达：收集各组细胞，裂解细胞后用BCA 法测定蛋白浓度，加SD上样缓冲液变性后，根据蛋白分子量配制相应浓度的SDS 胶加入RIPA及1%PMSF提取细胞蛋白，行SDS-PAGE 电泳后，电转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，4 ℃下与一抗孵育过夜，以 TBST漂洗后加入二抗常温孵育2 h×3次，洗膜后用显色剂ECL试剂显色、X线片压片处理后，扫描。QuantityOne软件定量分析条带的灰度值。

1.2.4 MTS检测各组细胞的增殖力：将对数增殖细胞分组,慢病毒转染处理后，隔24 h进行MTS检测。每孔加入MTS溶液20 μL，孵育2 h后，用酶标仪于490 nm处测出各孔吸光度(A)值。继续检测48、72、96、120和144 h各组细胞的吸光度值。

1.2.5 Hoechst 33258染色法观测细胞凋亡的情况：将Eca109细胞用慢病毒处理。于转染后120 h后，PBS清洗2次，固定液固定15 min，PBS 清洗，加入Hoechst 33258，37 ℃染色30 min，封片，荧光显微镜下观察细胞染色。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡：慢病毒分组处理后，于120 h后用PBS洗涤3次，无乙二胺四乙酸胰蛋白酶消化后，PBS洗涤3次，800 r/min 离心5 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.2.7 流式细胞术检测细胞周期：将处理的各组细胞用PBS洗涤3次，消化收集于离心管中，PBS洗涤2次，离心弃上清液，重悬于1 mL 70%乙醇中固定过夜，次日采用流式细胞术检测细胞周期比例。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Eca109细胞中慢病毒的转染效率

MAI为(0、10、20、30、40和50)时96 h感染效率分别为(0%、30%、60%、80%、95%和99%)，当MAI值为50时，转染效率高，细胞状态较好，故选择MAI值50转染细胞进行后续实验。

2.2 转染前后Eca109细胞中LATS1 mRNA及蛋白表达

LATS1 mRNA表达： Ad-LATS1组明显高于对照组和Ad-GFP组(P<0.05)；LATS1蛋白表达： Ad-LATS1组明显高于对照组和Ad-GFP组(P<0.05)(图1，表1)。

图1 慢病毒转染后各组细胞LATS1的mRNA及蛋白表达Fig 1 LATS1 mRNA and protein in lentivirus group of cells after transfection

groupLATS1mRNALATS1proteinCON0.2527±0.01960.2910±0.0080Ad-GFP0.2278±0.01120.3239±0.0168Ad-LATS10.8653±0.0280*0.8322±0.0328*

*P<0.05 compared with control group.

2.3 转染前后Eca109细胞中YAP、BAX、BCL-2的蛋白表达

Ad-LATS1转染组中YAP、BCL-2的蛋白表达量明显低于对照组和Ad-GFP组，而BAX的蛋白表达量明显高于对照组和Ad-GFP组(P<0.05)(图2，表2)。

图2 慢病毒转染后各组细胞YAP、BAX、BCL-2的蛋白表达情况Fig 2 YAP,BAX,BCL-2 protein in lentivirus groups of cells after transfection

group/proteinYAPBAXBCL-2CON0.3425±0.01970.4745±0.03480.8971±0.0162Ad-GFP0.3612±0.02960.4373±0.41670.8740±0.0228Ad-LATS10.2283±0.0211*0.6775±0.0176*0.5226±0.0251*

*P<0.05 compared with control group.

2.4 过表达LATS1对Eca109细胞增殖的影响

转染第5天开始，Ad-LATS1组的细胞吸光度(A)开始明显低于对照组及Ad-GFP组 (P<0.05,图3)。

*P

2.5 过表达LATS1对Eca109细胞凋亡的影响

对照组、Ad-GFP组、Ad-LATS1组的凋亡率分别为(6.15±0.45)%、(5.32±0.40)%和(22.46±1.52)%，LATS1转染组细胞的凋亡率明显高于其余组(P<0.05)(图4)。对照组、Ad-GFP组的Eca109细胞发出较弱的均匀的蓝色荧光，细胞系无明显的形态学改变； 而Ad-LATS1组凋亡细胞出现核浓染、碎裂，发出较强的蓝色荧光(图5)。

2.6 过表达LATS1对Eca109细胞周期的影响

Ad-LATS1组相较于其余组G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显减少(P<0.05)(图6，表3)。

3 讨论

人体内的HIPPO信号通路可通过负性调节下游YAP来抑制细胞生长和诱导细胞凋亡[2]。

图4 FCM测的各组细胞的凋亡率

图5 Hochest33258染色法观察各组细胞的凋亡

图6 FCM测各组细胞周期的结果图

group/cellcycleG1G2SCON63.94±0.755.40±0.4130.66±0.99Ad-GFP63.82±1.695.41±1.0730.77±2.76Ad-LATS174.72±1.21*5.47±1.2619.82±2.24*

*P<0.05 compared with control and Ad-GFP group.

HIPPO通路中编码丝氨酸/苏氨酸激酶的Wts和Sav共同作用从而调节细胞增殖和凋亡[3]。在非小细胞肺癌[4]与胃癌[5]中也已证实肿瘤组织中的YAP表达明显高于癌旁。多种细胞应激作用和促凋亡刺激因子可激活LATS1/2，能诱导BAX、caspase3的表达并抑制BCL-2的表达来促进细胞凋亡[6]。LATS1/2都能与下游YAP结合，可抑制YAP引起的癌变，但以LATS1对YAP的调控为主。近年来，通过沉默HeLa细胞中的LATS1，导致细胞增殖力及抵抗药物诱发凋亡的能力增强[7]；LATS1过表达能下调YAP的活性并对乳腺癌细胞迁移侵袭能力产生抑制作用[8]，也能抑制肺腺癌A549细胞的增殖及凋亡[9]。以上说明YAP为癌基因，而LATS1为其上游负调控的抑癌基因，LATS1能靶向调节YAP并对肿瘤的发生发展起重要作用。LATS1在食管癌上的研究尚未见报道。通过本实验发现：过表达LATS1的Eca109细胞YAP、BCL-2的蛋白表达明显降低而BAX明显增高，使食管癌Eca109细胞停滞在G1期而使其增殖受抑制并促进其凋亡。

LATS1及HIPPO通路在食管癌的发生发展中可能起到重要作用，有待进一步的研究发现。本文意在细胞层面上研究LATS1及HIPPO通路在食管癌中的作用，为日后进一步的组织动物实验及临床运用打下基础。

[1] Reddy P. Laboratory diagnosis of antiphospholipid syndrome[J].South Med J，2013，106: 439- 446.

[2] Chan EH1, Nousiainen M, Chalamalasetty RB,etal. The Ste20-like kinase Mst2 activates the human large tumor suppressor kinase Lats1[J]. Oncogene. 2005 Mar 17;24:2076- 2086.

[3] Halder G, Johnson RL. Hippo signaling: Growth control and beyond[J].Development 2011; 138: 9- 22.

[4] Da CL1, Xin Y, Zhao J,etal. Significance and relationship between Yes-associated protein and survivin expression in gastric carcinoma and precancerous lesions[J]. World J Gastroenterol,2009,15:4055- 4061.

[5] Zeng Q, Hong W. The emerging role of the hippo pathway in cell contact inhibition, organ size control, and cancer development in mammals[J]. Cancer Cell, 2008,13: 188- 192.

[6] Xia H, Qi H, Li Y,etal. LATS1 tumor suppressor regulates G2/M transition and apoptosis[J]. Oncogene, 2002,21:1233- 1241.

[7] Visser S, Yang X. Identification of LATS transcriptional targets in HeLa cells using whole human genome oligonucleotide microarray[J]. Gene,2010,449:22- 29.

[8] Zhang J, Smolen GA, Haber DA. Negative regulation of YAP by LATS1 underscores evolutionary conservation of the Drosophila Hippo pathway[J]. Cancer Res, 2008,68: 2789- 2794.

[9] 熊伟，吴庆琛，张诚. LATS1过表达对肺癌A549细胞增殖及周期的影响[J]. 中国细胞生物学学报, 2014, 36: 54- 59.

Overexpression ofLATS1 reduces the proliferation of Eca109 cells

LUO Jun, WANG Cong-yi, XIONG Wei, ZHANG Cheng, WU Qing-chen*

(Dept. of Thoracic Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China)

Objective To discuss the impact and mechanism on proliferation,apoptosis and cell cycle of Eca109 cells by overexpressLATS1 in lentivirus transfection technique. Methods Built LATS1-lentivirus vector then transfected the lentivirus vector into Eca109 cells；LATS1 mRNA expression was detected by real-time PCR；LATS1，YAP，BAX/BCL-2 protein expression was detected by western blotting；proliferation ability was detected by MTS assay；the ratio of apoptosis and cell cycle were detected by FCM；the dyeing of apoptosis was observed by hochest33258. Results After transfection ofLATS1-lentivirus in Eca109 cells(Ad-LATS1 group)，we found lats1 mRNA expression and protein expression level，BAX protein expression level were all remarkablely higher than control group and Ad-GFP groups while YAP,BCL-2 protein expression level were on the contrary(P<0.05)；The ratio of proliferation in Ad-LATS1 group was significantly lower than control group and Ad-GFP groups from the fifth day(P<0.05)；FCM showed more cells stay in G1phase in Ad-LATS1 group than in control group and-GFP groups while the ratio of cells in S phase were on the contrary and apoptosis rate was much higher in Ad-LATS1 group than in others(P<0.05)；Hoechst 33258 dying also demonstrated thatLATS1 could induce apoptosis in Eca109 cells through the degree and range of dyeing. ConclusionsLATS1 gene may up-regulate BAX whlle down-regulate YAP and BCL-2 to increase the apoptosis rate of Eca109 cells，more over，it potentially prolong the G1phase of cell cycle and shorten the S phase to inhibit the proliferation of Eca109 cells.

esophagus tumor；LATS1；YAP；proliferation；apoptosis

2014- 08- 29

2014- 12- 02

重庆市卫生局重点科研项目(2012- 1- 015)

1001-6325(2015)06-0792-05

R735.1

A

*通信作者(corresponding author)：wqc6@hotmail.com