来那度胺可抑制单核细胞向M2型巨噬细胞分化及相关细胞因子的分泌

魏 冲，姜志超，王昊天，张 薇，李天骄，汪 玄，周道斌

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 血液内科， 北京 100730)



研究论文

来那度胺可抑制单核细胞向M2型巨噬细胞分化及相关细胞因子的分泌

魏 冲#，姜志超#，王昊天，张 薇，李天骄，汪 玄，周道斌*

(中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 血液内科， 北京 100730)

目的探索来那度胺在肿瘤微环境中对于单核细胞向M2型巨噬细胞分化及IL- 10、VEGF和TGF-β1水平的影响。方法密度梯度离心法分离初治淋巴瘤患者及健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs)。用Transwell24孔板共培养PBMCs与淋巴瘤细胞系HUT- 78，并于共培养体系中加入来那度胺。流式细胞术分析肿瘤相关巨噬细胞(TAM)特征性表型CD68和CD163的表达，ELISA法检测共培养体系细胞因子IL- 10、VEGF和TGF-β1的含量。结果在PBMCs与HUT- 78构成的体外共培养体系中加入来那度胺后，CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞及CD68+CD163+在CD68+细胞中所占比例均有显著的下降(P<0.05)。加入来那度胺后患者组CD68+CD163+/ CD68+下降程度明显高于健康志愿者(P<0.05)。加入来那度胺的患者共培养组相对于未加来那度胺的共培养组IL- 10和VEGF水平均有显著下降(P<0.01，P<0.05)。结论来那度胺在PBMCs与淋巴瘤细胞构建的体外共培养体系中能够有效抑制单核细胞向M2型TAM的分化，且能够抑制患者组共培养体系中IL- 10、VEGF分泌。

来那度胺；淋巴瘤；肿瘤相关巨噬细胞

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)是指肿瘤微环境中的巨噬细胞。其来源于外周循环的单核细胞，可被肿瘤释放多种趋化因子招募到肿瘤组织中[1]。单核细胞在不同的刺激条件下可分化为M1或M2型两类功能截然不同的巨噬细胞[2]。既往研究认为，TAM以M2型巨噬细胞为主。M2型巨噬细胞具有CD68、CD163、CD209和CD206等特征性分子标志[3- 5]，且具有高分泌白细胞介素- 10(interleukin- 10，IL- 10)的特性，在肿瘤微环境中能够促肿瘤细胞增殖、存活、浸润及转移。近来大量研究发现，TAM的大量浸润与多种类型淋巴瘤的不良预后密切相关[6- 8]。

针对TAM的免疫治疗和靶向治疗药物的探索已成为近几年的研究热点。来那度胺(Lenalidomide)是第2代免疫调节剂，在抗肿瘤血管新生、抑制肿瘤细胞增殖和免疫调节等多个方面起到抗肿瘤的作用。在免疫调节方面，来那度胺能够促进T细胞分泌干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)和IL- 12等因子，而以上因子有利于单核细胞向M1型巨噬细胞分化。因此，来那度胺有可能在一定程度上通过促进单核细胞向M1型巨噬细胞分化、抑制其向M2型巨噬细胞分化而起到抗肿瘤的作用。本实验前期研究初步建立了体外条件下模拟单核细胞向TAM转化的模型[9]。本研究将继续利用以上模型，研究来那度胺对于单核细胞向TAM分化的影响及其对于体系中IL- 10、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

来那度胺(Celgene 公司)；HUT- 78 人外周T细胞淋巴瘤细胞系，RPMI- 1640(改良型)培养基，胎牛血清，细胞培养用抗生素(中国医学科学研究院基础所细胞中心)；Ficoll淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限公司)；抗人CD14-APC抗体、抗人CD14-PerCP抗体、抗人CD68-FITC抗体、抗人CD163-PE抗体、6色CantoII流式细胞仪(BD公司)；人IL- 10 ELISA检测试剂盒、人VEGF ELISA检测试剂盒和人TGF-β1ELISA检测试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；Transwell 24孔板(Corning公司，PET材质，孔径0.4 μm，嵌套直径6.5 mm)；

1.2 实验方法

1.2.1 淋巴瘤细胞系HUT- 78的培养：37 ℃、95%湿度、5% CO2条件下，RPMI- 1640(改良型)+胎牛血清(终浓度10%)+双抗(终浓度0.5%)，细胞培养浓度维持于2×108/L～8×108/L，每3～4天传代1次。

1.2.2 外周血单个核细胞(peripheral blood mononudear cells,PBMCs)的分离：本实验选择北京协和医院2013年2月至2013年6月确诊的18例初治淋巴瘤患者及8例健康志愿者，抽取9 mL外周血作为PBMCs的来源。标本采集得到北京协和医院伦理委员会的批准。利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMC)。

1.2.3 来那度胺实验溶液的配置：用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解来那度胺，配制成5 mmol/L的来那度胺溶液。实验中，每1 mL培养基中加入1 μL，来那度胺的终浓度为5×10-3mmol/L。1.2.4 共培养体系:采用24孔Transwell共培养。实验分为淋巴瘤患者与健康志愿者两个系列，每个系列的分组如下：1组(淋巴瘤细胞单独培养组)：将HUT- 78细胞悬液调整浓度为20×107个/L，1 mL HUT- 78细胞悬液加入24孔板中。2组(淋巴瘤细胞单独培养组+来那度胺)：于1组的培养孔中每孔加入1 μL来那度胺溶液。3组(PBMCs单独培养组)：将分离所得PBMCs调整为150×107个/L, 200 μL细胞悬液加入24孔板中，加入RPMI- 1640培养基定容至1 mL。4组(PBMCs与淋巴瘤细胞共培养组)：将细胞浓度为150×107个/L的PBMCs悬液200 μL加入上层Transwell嵌套内。将浓度为20×107个/L的HUT- 78细胞悬液1 mL加入下层。5组(PBMCs与淋巴瘤细胞共培养+来那度胺)：于2组共培养体系的Transwell嵌套内加入 0.2 μL来那度胺溶液，下层的24孔板中并加入1 μL来那度胺溶液。将上述各组细胞放入37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养96 h。

1.2.5 TAM的特征性表型的检测：收集3×105外周血分离所得PBMCs(培养前)及3组、4组、5组培养96 h后的PBMCs，以抗人CD14-APC或 CD14-PerCP抗体、抗人CD68-FITC抗体和抗人CD163-PE抗体标记细胞，通过流式细胞仪检测细胞表面CD14、CD68和CD163的表达。

1.2.6 培养上清液IL- 10、VEGF和TGF-β1含量检测：培养96 h后收集各培养组的细胞培养上清,通过ELISA法检测细胞因子IL- 10、VEGF和TGF-β 13种因子含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象的临床资料

本研究共纳入北京协和医院2013年2月至2013年6月确诊的18例初治淋巴瘤患者及8例健康志愿者作为对照样本，患者病理类型见表1。

2.2 来那度胺对单核细胞向TAM分化的影响

以CD14设门，对比各培养组CD14+细胞群中CD68+、CD163+和CD68+CD163+细胞所占的比例。

表1 18位初治淋巴瘤患者的病理类型

编号01患者流式检测结果图及各群细胞比例说明如图1所示。18例患者各培养组中CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞及CD68+CD163+在CD68+细胞中所占比例均值对比如图2所示。

P3.CD68+cells; P4 CD163+cells; Q2.CD68+CD163+cells; A.illustration of the proportion of different cell populations; B.PBMCs cultured alone; C.PBMCs cultured with lymphoma cells; D.PBMCs cultured with lymphoma cells + lenalidomide

图1 01号患者流式检测结果图

Fig 1 Flow cytometry results of No.1 patient

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBMCs cultured alone group; #P<0.01 compared with co-cultured group without lenalidomide图2 18例患者各培养组CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞比例及CD68+CD163+细胞在CD68+中所占比例(%)的均值对比图Fig 2 Comparison of the proportion of CD68+, CD163+, CD68+CD163+cells and CD68+CD163+/ CD68+cells in different groups of 18 patients

对8名健康志愿者采用与患者组相同的检测及分析方法，所得结果如图3所示。

*P<0.05,**P<0.01 compared with PBMCs cultured alone group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with co-cultured group without lenalidomide图3 8例健康志愿者各培养组CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞比例及CD68+CD163+细胞在CD68+中所占比例(%)的均值对比图Fig 3 Comparison of the proportion of CD68+, CD163+, CD68+CD163+cells and CD68+CD163+/ CD68+cells in different groups of 8 healthy controls

在患者及健康志愿者中，与PBMCs单独培养组相比，PBMCs与淋巴瘤细胞共培养组CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞比例及CD68+CD163+在CD68+中所占比例均出现显著升高趋势(P<0.05)。共培养组加入来那度胺后，以上比例均有显著下降，除健康志愿者组CD68+CD163+/ CD68+外，均具有显著性差异(患者组P<0.01，健康志愿者P<0.05)。对比患者及健康志愿者，加入来那度胺后患者CD68+CD163+/ CD68+比例下降程度明显高于健康志愿者(P<0.05)。

2.3 各组细胞培养上清 IL- 10、VEGF和TGF-β1含量分析

5名患者及5名健康志愿者各培养组的细胞培养上清的IL- 10、VEGF和TGF-β1ELISA检测。各培养组ElISA检测结果如图4，5，6所示。

*P<0.05, **P<0.01 compared with culture without lenalidomide图4 患者与健康志愿者加入来那度胺与未加来那度胺IL- 10浓度对比图Fig 4 Comparison of IL- 10 concentration detected by ELISA in patients and healthy controls

*P<0.05 compared with culture without lenalidomide图5 患者与健康志愿者加入来那度胺与未加来那度胺VEGF浓度对比图Fig 5 Comparison of VEGF concentration detected by ELISA in patients and healthy controls

图6 患者与健康志愿者加入来那度胺与未加来那度胺TGF-β1浓度对比图Fig 6 Comparison of TGF-β1 concentration detected by ELISA in patients and healthy controls

加入来那度胺的HUT- 78培养组较HUT- 78单独培养组其IL- 10浓度明显下降(P=0.022)，VEGF 与TGF-β1浓度无明显变化。在患者组，加入来那度胺的共培养组相对于未加来那度胺的共培养组IL- 10 与VEGF浓度均有显著下降(P<0.05)。在健康志愿者组，加入来那度胺的共培养组相对于未加来那度胺的共培养组IL- 10浓度有显著下降(P<0.05)，VEGF 与TGF-β1浓度未见明显差异。IL- 10浓度的下降程度在患者与健康志愿者无显著差异。

3 讨论

来那度胺是第2代免疫调节剂，相对于沙利度胺，其具有更强的抗肿瘤和免疫调节作用，主要用于骨髓增生异常综合征及多发性骨髓瘤的治疗。来那度胺可通过抗肿瘤血管新生、促抑癌基因表达、促肿瘤细胞凋亡等多种机制发挥抗肿瘤的作用[10- 11]。

CD14为单核细胞及巨噬细胞均表达的分子标志，CD68和CD163分别为巨噬细胞和M2型巨噬细胞的分子标志。CD14+细胞群中CD68+、CD68+CD163+细胞所占的比例分别代表巨噬细胞及M2型巨噬细胞在单核细胞及巨噬细胞总体中所占的比例。CD68+CD163+占CD68+细胞的比例代表M2型巨噬细胞在巨噬细胞总体中的比例。本实验发现，PBMCs与淋巴瘤细胞共培养组CD68+、CD163+、CD68+CD163+细胞比例较PBMCs单独培养组均呈显著升高，共培养体系加入来那度胺后，以上比例均有显著下降。以上结果表明淋巴瘤细胞具有促进单核细胞向M2型巨噬细胞分化的作用，而来那度胺在共培养体系中能够有效抑制单核细胞向M2型巨噬细胞分化。对比患者及健康志愿者发现，来那度胺对于患者组的抑制作用较健康志愿者组更明显，且具有统计学差异。

IL- 10是一种免疫抑制因子，能通过多种途径抑制机体的抗肿瘤免疫。VEGF能够促肿瘤血管新生，并干扰树突细胞、阻断B细胞和T细胞的抗原呈递导致肿瘤产生免疫逃逸。肿瘤细胞分泌的IL- 10、VEGF和TGF-β能够促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化，而分化而来的M2型巨噬细胞及肿瘤细胞共同分泌大量的IL- 10、VEGF 和TGF-β抑制机体的抗肿瘤免疫。本实验发现，来那度胺对单核细胞向M2型巨噬细胞分化及其对IL- 10 和VEGF的分泌同时存在抑制作用的，提示来那度胺可能通过抑制以上细胞因子的分泌进而抑制单核细胞向M2型巨噬细胞分化。

本实验所构建的共培养模型为探寻针对TAM的靶向治疗和免疫治疗药物提供了简单可行的体外研究模型。由于实验的局限性及体内体外环境的巨大差异，来那度胺抗肿瘤的作用机制仍有待后续研究的不断探索。

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Lenalidomide significantly inhibits the differentiation of monocytes to M2 polarized macrophages and down-regulates secretion of associated cytokines

WEI Chong#, JIANG Zhi-chao#, WANG Hao-tian, ZHANG Wei, LI Tian-jiao,WANG Xuan, ZHOU Dao-bin*

(Dept.of Hematology, PUMC Hospital, CAMS & PUMC, Beijing 100730, China)

Objective To explore the impact of anti-cancer drug Lenalidomide on the differentiation of monocytes to M2 polarized macrophages and the secretion of IL- 10， VEGF and TGF-β1. Methods The peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation from peripheral blood of both lymphoma patients and healthy controls. Then PBMCs were co-cultured with HUT-78 lymphoma cells in Transwell 24-well plates. Anti-cancer drug Lenalidomide was added into the co-culture system. Expressions of the markers of TAMs (CD68 and CD163) were tested by flow cytometry. IL- 10, VEGF and TGF-β1 level in the co-culture system were detected by ELISA. Results Treatment with Lenalidomide significantly decreased the proportion of CD68+, CD163+，CD68+CD163+cells and the proportion of CD68+CD163+/ CD68+cells(P<0.05). The degree of decline of CD68+CD163+/ CD68+cells was more significant in patients than that in healthy controls(P<0.05). The reatment with Lenalidomide significantly decreased the IL- 10 and VEGF level in the co-culture system(P<0.01，P<0.05). Conclusions Lenalidomide significantly inhibits the differentiation of monocytes to M2 polarized macrophages and down-regulate the secretion of IL- 10 and VEGF in the co-culture system in patient group.

lenalidomide; lymphoma; tumor-associated macrophage

2014- 05- 12

2014- 12- 29

北京市自然科学基金(7122140)

1001-6325(2015)06-0786-06

R733.4

A

*通信作者(corresponding author)：daobinzhou@yahoo.com

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