细颗粒物PM2.5暴露加重博来霉素致大鼠肺纤维化

段 争，吴翠红

(1.河北医科大学第二医院 呼吸二科， 河北 石家庄 050000； 2.故城县医院 内一科， 河北 衡水 253800)



研究论文

细颗粒物PM2.5暴露加重博来霉素致大鼠肺纤维化

段 争1*，吴翠红2

(1.河北医科大学第二医院 呼吸二科， 河北 石家庄 050000； 2.故城县医院 内一科， 河北 衡水 253800)

目的探讨细颗粒物(PM2.5)暴露对博来霉素致大鼠肺纤维化的影响。方法将大鼠分为4组：1)对照组 (N组)；2)PM2.5组(PM组)；3)博来霉素组(BLM) (B组)；4)PM2.5+博来霉素组(PM+B组)；每组再分为4个亚组，均为6只。分别予以气管内滴注0.9%氯化钠注射液(1.5 mL/kg)，PM2.5悬液(3.75 mg/kg)，BLM悬液(3.5 mg/kg), BLM和PM2.5混悬液，于 3、7、14和21 d处死大鼠，行肺组织HE染色和Masson染色，进行肺泡炎及肺纤维化评分，计数肺泡灌洗液(BALF)中白细胞及分类，ELISA法测BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量；Western blot测定Toll 样受体(TLR)2和TLR4蛋白表达；测定肺组织匀浆中羟脯氨酸含量。结果B组和PM+B组体质量较N组明显下降，PM+B组较B组体质量明显下降(P<0.05)。B组和PM+B组肺泡炎及肺纤维化评分显著高于N组和PM组。B组和PM+B组白细胞总数及中性粒细胞比例、BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量及肺组织羟脯氨酸含量均显著高于N组和PM组(P<0.05)，且PM+B组高于B组。PM组、B组、PM+B组肺组织TLR2、TLR4蛋白表达显著高于N组(P<0.05)，PM+B组显著高于B组和PM组。结论PM2.5暴露加重博来霉素致大鼠肺纤维化，其机制可能通过上调肺组织TLR2及TLR4表达和增加IL- 6、TNF-α及TGF-β1分泌。

细颗粒物；博来霉素；肺纤维化；Toll 样受体(TLR)

肺纤维化病因不明,肺泡炎性反应是其特征之一，氧化-抗氧化失衡在其发展中发挥关键作用，环境中粉尘参与了肺纤维化的发生发展。细颗粒物(PM2.5)可沉积于支气管及肺泡，并可吸附病原微生物、芳香烃等物质。研究证实PM2.5暴露可通过诱发肺脏炎性反应和诱导氧化应激等途径参与肺炎、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)等呼吸系统疾病的发病[1- 3]。PM2.5暴露是否参与肺纤维化的发生发展尚不清楚。本研究气管内滴入博莱霉素建立大鼠肺纤维化模型，气管内滴入PM2.5进行干预，探讨PM2.5暴露对大鼠肺纤维化的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级6～8周龄雌性SD大鼠96只，体质量200～220 g，(河北医科大学实验动物中心，合格证号：1302094)。PM2.5(石家庄市环境监测中心)，以蒸馏水配制成7.5 mg/mL悬液备用。博来霉素(BLM)A(天津太河制药有限公司)；白细胞介素(IL)- 6试剂盒、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒和转化生长因子(TGF)-β1试剂盒(均河北博海生物工程开发有限公司)；羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠Toll样受体(TLR)2一抗、TLR4一抗(Santa Cruz公司)；山羊抗兔TLR2二抗、TLR4二抗(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备：96只大鼠分为对照组(N组)；PM2.5组(PM组)：气管内滴入PM2.5悬液(3.75 mg/kg)；博来霉素组(B组)：博来霉素A5以3.5 mg/kg气管内滴入；PM2.5与博来霉素联合组(PM+B组)：博来霉素A5与PM2.5配成混悬液气管内滴入。各组按照不同时间点(3、7、14和21 d)分为4个亚组，每个亚组6只，于各时间点处死大鼠，取材测定相应指标。

1.2.2 体质量测量：记录大鼠体质量，计算体质量变化值=各时间点体质量值-初始体质量值。

1.2.3 肺病理组织学染色及分级：取右肺下叶，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，行HE染色和Masson染色。参照文献进行肺泡炎和肺纤维化程度分级评分，各分为4级。

1.2.4 肺泡灌洗液(BALF)细胞计数及分类：3 mL 4 ℃ 0.9%氯化钠注射液行左肺灌洗，反复抽吸3次，回收全部BALF，4 ℃1 200 r/min离心10 min，离心半径10 cm。用计数板在光镜下细胞计数，瑞氏染色，油镜下行细胞分类计数，共计数200个细胞。

1.2.5 BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1的测定：BALF离心后取上清液，-80 ℃保存备用。用酶联免疫吸附试验方法测定，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.6 肺组织羟脯氨酸(HYP)含量测定：取21 d大鼠右肺上叶-70 ℃保存备用。用碱水解法测定，具体步骤按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 体质量改变

B组与PM+B组体质量在7 d时降至最低，B组和PM+B组体质量较N组明显减低(P<0.05)；PM+B组较B组体质量明显减低(P<0.05)。

2.2 肺组织病理学改变

PM组早期呈肺泡炎改变，后期肺泡炎恢复。B组早期呈肺泡炎表现，后期肺泡炎减轻，以纤维化为主。PM+B组改变与B组大体相同，早期肺泡炎及后期纤维化程度明显加重(图1)。

2.3 肺组织病理分级评分

肺泡炎评分：PM组在3 d时高于N组(P<0.05)，PM+B组和B组在各时间点均显著高于N组和PM组，PM+B组在3和7 d时显著高于B组(P<0.05)。肺纤维化评分：B组和PM+B组在7、14和21 d时显著高于N组和PM组(P<0.05)，PM+B组14 d时显著高于B组(P<0.05)。

2.4 BALF中白细胞计数及分类比较

PM组3 d时BALF中白细胞总数及中性粒细胞比例显著高于N组(P<0.05)，B组和PM+B组在各个时间点均显著高于N组和PM组(P<0.05)，PM+B组高于B组(P<0.05)(表1)。

2.5 BALF中IL- 6、TNF-α、TGF-β1及肺组织中HYP含量比较

PM组3 d时BALF中IL- 6、TNF-α显著高于N组(P<0.05)，B组和PM+B组BALF中IL- 6、TNF-α和TGF-β1含量及肺组织HYP含量在各检测点均显著高于N组和PM组(P<0.05)，PM+B组高于B组(表2)。

2.6 肺组织中TLR2、TLR4蛋白表达

N组、PM组、B组和PM+B组肺组织TLR2吸光度比值分别为0.442±0.002、0.491±0.002、0.546±0.002和0.731±0.003；TLR4吸光度比值分别为0.414±0.001、0.486±0.002、0.484±0.001和0.726±0.001。PM组、B组和PM+B组肺组织TLR2和TLR4表达显著高于N组，PM+B组显著高于B组和PM组(P<0.05)(图2)。

A～D.HE； E～F.Masson; A.group N; B.group PM; C.group B; D.group PM+B; E.group N; F.group PM; G.group B; H.group PM+B (×100)

图1 各组大鼠第21天肺脏病理改变

*P<0.05 compared with N group;△P<0.05 compared with PM group;▲P<0.05 compared with B group.

图2 各组大鼠肺组织TLR2、TLR4蛋白表达

groupIL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)3days7days3days7daysN15.4±1.117.3±1.367.7±4.162.9±2.5PM33.8±1.4*19.5±1.1101.3±3.2*63.1±3.2B49.0±0.9*△101.5±2.0*△162.3±8.2*△258.8±6.9*△PM+B79.4±2.2*▲△125.6±3.6*▲△268.6±5.9*▲△410.8±7.8*▲△groupTGF-β1(ng/L)HYP(μg/g)3days7days14days21days21daysN50.8±1.839.8±2.641.3±0.832.3±1.1141.0±5.5PM52.9±2.140.0±2.340.7±1.534.0±1.5148.5±5.3B154.1±5.7*△169.5±7.1*△197.3±4.1*△184.6±4.5*△437.0±12.7*△PM+B176.5±7.6*▲△196.1±7.7*▲△223.1±4.5*▲△192.2±4.6*△523.1±10.9*▲△

*P<0.05 compared with N group;△P<0.05 compared with PM group;▲P<0.05 compared with B group.

3 讨论

本研究证实PM2.5暴露可致大鼠肺脏炎性反应，无肺纤维化，BLM与PM2.5联合组较BLM组肺纤维化加重，提示PM2.5暴露加重肺纤维化。有关PM2.5对肺纤维化影响的研究较少，且结果不一致。14纳米碳黑颗粒可加重BLM诱导的大鼠肺脏炎性反应和纤维化[4]。大鼠气管内滴入90纳米碳黑颗粒不加重BLM诱导的肺纤维化，胸膜内联合予以BLM及碳黑颗粒可加重BLM诱导的胸膜下纤维化[5]。这些研究结果的差异与实验应用的颗粒物化学成分、大小及给药方式等不同相关。

本研究表明联合组BALF细胞数、IL- 6、TNF-α及TGF-β1均较BLM组增高，提示PM2.5暴露加重BLM诱导的肺脏炎性反应。TNF-α可促进细胞间黏附，放大炎性反应级联反应，IL- 6可促进纤维化相关介质TGF-β1、CCL- 3上调，TGF-β1是成纤维细胞招募、激活和分化的中心调节者。因而PM2.5诱导的炎性反应介质升高不仅引起炎症性肺损伤, 还可诱导炎性反应级联反应，加重肺纤维化。

Toll 样受体(Toll-like receptor, TLR) 是一类天然免疫模式识别受体，TLR4和TLR2是应答颗粒物的主要受体。关于PM2.5暴露对于TLRs影响的研究结果并不一致，PM2.5暴露引起大鼠BALF和血中TLR2和TLR4阳性细胞下降[6]；亚洲沙尘暴颗粒联合肺炎克雷伯杆菌可增加TLR2表达，抑制TLR4表达[7]；香烟烟雾使人巨噬细胞TLR4mRNA上调[8]。本研究证实PM2.5暴露使肺组织TRL2、TRL4表达上调。TLRs参与了肺纤维化的进程。肺纤维化患者BALF淋巴细胞TLR2表达升高[9]。BLM上调大鼠肺组织TLR2表达[10]，TLR2受体阻断剂可减弱BLM的炎性反应效应和纤维化效应[11]。TLR活化后启动细胞内信号，激活MAPK家族，启动下游炎性反应介质，加重肺纤维化。

本研究证实PM2.5暴露通过上调肺组织TLR2、TLR4表达，使IL- 6、TNF-α、TGF-β1分泌增加，加重肺脏炎性反应及纤维化。

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Exposure to PM2.5 enhances Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

DUAN Zheng1*, WU Cui-hong2

(1.the Second Dept. of Respiratory, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000;2.Dept. of Medicine, Gucheng County Hospital, Hengshui 253800, China)

Objective To investigate the effects of exposure to PM2.5 on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Methods Rats were divided into four groups：1) control group(group N); 2)PM2.5 group(group PM); 3)BLM group(group B); 4)PM2.5 plus BLM group (group PM+B)；Each group was divided into four groups. Rats were injected of normal saline (1.5 mL/kg), PM2.5 suspended in saline(3.75 mg/kg), bleomycin (3.5 mg/kg) and PM2.5 combined with BLM in saline into trachea respectively. The rats were sacrificed on day 3, 7, 14 and 21. The lung were stained with HE and Masson’s trichrome to estimate the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis. Bronchoalveolar lavage fluid(BALF)was collected and cells in BALF were counted. The levels of IL- 6,TNF-α and TGF-β1 in BALF were detected by the method of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA). Western blot was performed to detect the protein level of TLR2 and TLR4 in lung. The lung was made into tissue homogenate which were used for measuring the contents of HYP in pulmonary tissue. Results The body weight of rats in group B and group PM+B significantly decreased as compared with that in the group N. The rats in group B and group PM+B exhibited significant alveolar inflammation and fibrosis as compared with that of group N and group PM. The numbers of WBC in BALF and the concentration of IL- 6, TNF-α, TGF-β1 and hydroxyproline were significantly elevated in Group B and group PM+B as compared with that in group N and group PM. The protein level of TLR2 and TLR4 in the lungs in group B, group PM and group PM+B was significantly higher than that in group N.Conclusions Exposure to PM2.5 may impact the concentration of IL- 6, TNF-α and TGF-β1 by increasing TLR2 and TLR4 expession, which exaggerate BLM-induced inflammation and fibrosis of the lung.

fine particulate matter; bleomycin; pulmonary fibrosis; Toll-like receptor (TLR)

2014- 12- 01

2015- 03- 25

河北省省级科技计划(15277701D)

1001-6325(2015)06-0781-05

R563.9

A

*通信作者(corresponding author)：duanzheng1971@126.com