LOX与HIF- 1α在非小细胞肺癌中表达增强

赵 鹏，郑贸根，程 光，王国臣，侯静朴，李作生

(河北联合大学，河北 唐山 063000)



研究论文

LOX与HIF- 1α在非小细胞肺癌中表达增强

赵 鹏，郑贸根*，程 光，王国臣，侯静朴，李作生

(河北联合大学，河北 唐山 063000)

目的研究赖氨酰氧化酶(LOX)与低氧诱导因子- 1α(HIF- 1α)在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达情况及其临床意义。方法收集临床NSCLC组织标本41例，用免疫组织化学染色法(IHC)检测NSCLC组织中LOX和HIF- 1α蛋白表达；蛋白印迹法(Western blot)检测NSCLC组织及相应的癌旁组织、正常肺组织中LOX与HIF- 1α蛋白表达。结果IHC结果显示LOX蛋白表达主要在细胞质，HIF- 1α蛋白表达主要在细胞核。LOX与HIF- 1α在NSCLC组织中阳性表达率均明显高于正常肺组织(P<0.05)；LOX蛋白的高表达与肿瘤的病理类型、分化程度、淋巴转移和临床分期之间存在显著相关(P<0.05)；HIF- 1α蛋白的高表达与肿瘤的病理类型、大小、淋巴转移和临床分期之间存在显著相关(P<0.05)；LOX与HIF- 1α蛋白在NSCLC组织中表达呈正相关性(P<0.05)。Western blot结果显示NSCLC组织中LOX与HIF- 1α蛋白的表达显著高于相应的癌旁组织及正常肺组织(P<0.05)。结论LOX与HIF- 1α的异常表达可能与NSCLC发生、发展有关，并且LOX与HIF- 1α的高表达可能协同促进了NSCLC的侵袭转移。

LOX;HIF- 1α;非小细胞肺癌

低氧诱导因子- 1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF- 1α)在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，包括肿瘤内血管生成、肿瘤扩散及能量代谢等[1- 2]。尽管HIF- 1α在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)方面做了相关性研究[3- 6]，但将HIF- 1α作为一个独立的肿瘤诊断治疗因子可能是不够的，应该考虑结合其他的肿瘤生物标志物。

最近，HIF- 1α在诱导肿瘤的进展机制中，赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase, LOX)已被确定为一个重要的监管基因。LOX的主要功能是稳定细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的共价交联，在正常结缔组织中发挥着重要的作用[7]。因此，异常的LOX表达或酶活性的改变将导致一系列与细胞外基质有关的疾病，包括癌症。已有证据表明，LOX异常表达会增加NSCLC入侵与转移[8]。然而，LOX与HIF- 1α之间是否存在一些关联性，LOX和HIF- 1α在NSCLC中扮演着什么角色有待进一步研究。

本研究探讨LOX和HIF- 1α在NSCLC发生发展、侵袭转移中的作用及两者关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验标本：收集2013年5月至2014年9月河北联合大学附属医院及唐山市人民医院部分手术切除的NSCLC组织及其相应的癌旁组织(距离肿瘤边缘<2 cm)、远处正常肺组织(距离肿瘤边缘>5 cm)共41例。所取标本均分成两份:一份手术切除后立即放入液氮、-80 ℃冰箱保存,用于Western blot检测;另一份经4%甲醛液固定,常规石蜡包埋用于IHC。所有标本均取得患者知情并同意。所有病理均有详细的临床资料，术前均未接受任何抗癌治疗。

1.1.2 主要试剂：LOX一抗(兔单克隆抗体,Sigma公司)；HIF- 1α一抗(兔单克隆抗体,Affinity公司);SP免疫组化试剂盒和DAB显色剂(北京中杉金桥公司); RIPA细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京博奥森公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色(IHC)：石蜡包埋组织块4.5 μm连续切片，常规免疫组化SP法染色按使用说明书操作，微波修复抗原，一抗(HIF- 1α,1∶100; LOX,1∶100)4 ℃过夜，PBS缓冲液代替一抗做阴性对照，其余操作不变。结果判断：HIF- 1α和LOX表达的评估是着色细胞的百分比和染色强度。至少选择5个高倍视野(×400)阳性细胞数所占比例。1)阳性表达细胞数为0计为0分;阳性表达细胞数<25%计为1分;阳性表达细胞数25%～50%计为2分;阳性表达细胞数50%～75%计为3分;阳性表达细胞数>75%计为4分。2)表达强度:无阳性信号,计为0分;阳性信号弱呈淡棕色,细颗粒状,计为1分;阳性信号中等,呈棕色,粗颗粒状,计为2分;阳性信号强烈，呈棕褐色，小块状，记为3分。两项相加，0分为阴性，2～3分为弱阳，4～5分为中度阳，6～7分为强阳。

1.2.2 蛋白印迹法(Western blot)：1)蛋白提取和蛋白浓度测定按试剂盒说明书进行；2)等量蛋白被12%SDS-PAGE电泳分离；3)100 mA，2 h的条件湿转至PVDF膜上；4)5%脱脂奶封闭1 h，加一抗β-Tublin、LOX、 HIF- 1α 4 ℃过夜;5)TBST液洗膜3次，加二抗室温1 h；6)TBST液洗膜3次，用ECL发光剂显影，全自动数码成像分析系统对结果进行分析；7)ImageJ图像分析软件测定各显色条带灰度值，以目的蛋白/β-Tublin比值表示。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

阳性染色颗粒呈棕黄色或棕褐色。HIF- 1α主要表达于细胞核，LOX主要表达于细胞质(图1)。NSCLC肿瘤组织中HIF- 1α的阳性表达率63.4%(26/41)显著高于正常组织的阳性表达率53.7%(12/41)(P<0.05)。HIF- 1α的表达与NSCLC的病理类型、肿瘤大小、淋巴转移和临床分期均显著相关(P<0.05)(表1)。

A.negative expression of HIF- 1α in NSCLC； B.positive expression of HIF- 1αin NSCLC；C.negative expression of LOX in NSCLC； D.positive expression of LOX in NSCLC

图1 免疫组织化学方法检测非小细胞肺LOX、HIF- 1α的表达

*P<0.05 compared with adenocarcinoma；▲P<0.05 compared with well+moderate；△P<0.05 compared with size <3 cm；#P<0.05 compared with no lymph node metastasis；★P<0.05 compared with pathological stageⅠ.

NSCLC肿瘤组织中LOX的阳性表达率73.2%(30/41)显著高于正常组织的阳性表达率43.9%(18/41)(P<0.05)。LOX的表达与NSCLC的病理类型、分化程度、淋巴转移和临床分期均显著相关(P<0.05)(表1)。

在NSCLC组织中，HIF- 1α与LOX蛋白的表达呈显著正相关(P<0.05)(表2)。

表2 HIF- 1α与LOX蛋白表达之间的关系

2.2 Western blot检测NSCLC组织中HIF- 1α、LOX蛋白表达

41例NSCLC组织中HIF- 1α蛋白表达量的相对吸光度A值为(1.014±0.119)，显著高于肿瘤旁组织(0.564±0.206)及正常肺组织(0.445±0.127)(P<0.05)；LOX蛋白表达量为(1.062±0.155)，显著高于肿瘤旁组织(0.599±0.233)及正常肺组织(0.601±0.232)(P<0.05)(图2，3)。

T.tumor； P.paraneoplastic； N.normal图2 Western blot检测非小细胞肺癌HIF- 1α、LOX蛋白表达Fig 2 Expression of LOX, HIF- 1α protein in NSCLC by Western blot

*P<0.05 compared with paraneoplasic and normal图3 LOX、HIF- 1α蛋白在非小细胞肺癌组织中的相对表达Fig 3 LOX and HIF- 1α protein relative expression in NSCLC

3 讨论

低氧是恶性肿瘤发展过程中普遍存在的现象，其与肿瘤的转移显著正相关，但低氧促进肿瘤转移的确切分子机制仍不清楚。HIF- 1α作为一种低氧生物学标志物，介导低氧反应[9]，其靶基因调控着细胞能量代谢、血管生成、肿瘤发生和其他生物过程[1- 2]。LOX是一种铜(Cu)依赖的氨基氧化酶，其基因携有活性“低氧应答元件(HREs)”，因此其对低氧有高反应性[10- 12]。已有研究表明在低氧状态下，高表达LOX会促进肿瘤转移[13]。由于LOX 活性是位于细胞核内，它作为一个关键的细胞外基质信号能够调节其底物表达[14]，所以低氧诱发LOX和其底物的上调伴随着癌上皮细胞向间皮细胞转化可能是促肿瘤转移的重要机制。本研究用临床NSCLC组织标本，通过免疫组织化学染色法、蛋白印迹法对LOX、HIF- 1α进行了检测，结果显示，LOX、HIF- 1α在NSCLC组织中表达水平均明显高于癌旁组织及正常肺组织，提示两者在NSCLC的发生中发挥着重要作用。本研究结合临床病理特征发现HIF- 1α蛋白的高表达还与NSCLC病理类型、大小、淋巴结转移和临床分期相关联，LOX蛋白的高表达与NSCLC病理类型、分化程度、淋巴转移和临床分期相关联。LOX和HIF- 1α蛋白表达之间呈正相关性。这些数据表明，HIF- 1α、LOX蛋白的过度表达可能协同促进NSCLC进一步发展和侵袭转移。

综上所述，HIF- 1α和LOX在NSCLC的发生发展中均发挥着重要作用，并且两者之间协同促进NSCLC的侵袭转移。然而，HIF- 1α和LOX在NSCLC发生、转移中的确切机制仍需要进一步研究，更清晰的解释机制将为治疗NSCLC提供新的基因疗法。

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Enhancement of LOX and HIF- 1α expressions in non-small cell lung cancer

ZHAO Peng, ZHENG Mao-gen*, CHENG Guang, WANG Guo-chen, HOU Jing-pu, LI Zuo-sheng

(Hebei United University, Tangshan 063000, China)

Objective To investigate the expression and clinical significance of lysyl oxidase(Lox) and hypoxia inducible factor-1α(HIF- 1α) in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods Fourty one cases of NSCLC tissue specimen were collected and examined for the expression of LOX and HIF- 1α protein in NSCLC by immunohistochemical (IHC); Protein expression of HIF- 1α and LOX of NSCLC tissus, corresponding paraneoplastic tissues and normal lung tissue was examined by Western blot. Results LOX protein mainly expressed in the cytoplasm, HIF- 1αprotein in the nucleus. The positive expression rate of LOX or HIF- 1α in NSCLC tissues was significantly higher than that of paired normal tissues (P<0.05); The high expression of LOX protein is remarkably related with pathological type,tumor differentiation, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05); The high expression of HIF- 1α protein is significantly related to pathological type,tumor size, lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05); The LOX protein was positively correlated with the HIF- 1α protein expression in NSCLC(P<0.05). HIF- 1α or LOX protein expression levels in NSCLC was significantly higher than that of paired paraneoplastic tissues and normal tissues(P<0.05).Conclusions LOX or HIF- 1α abnormal expression is potentially relevant to occurrence and development of NSCLC, and higher expression of them may act in synergy to promote the invasion and metastasis of NSCLC.

LOX; HIF- 1α; non-small cell lung cancer

2014- 10- 20

2014- 12- 26

河北省2013年医学科学研究重点课题(08176)

1001-6325(2015)06-0776-05

R734.2

A

*通信作者(corresponding author)：415247121@qq.com