妊娠中期妇女超甲基化RASSF1A基因表达水平与子痫前期的关系

旷文佳 陈美华 董晨

子痫前期是妊娠期特有的疾病，是导致孕产妇及围生儿患病及死亡的重要原因之一[1]。早期监测该病的发生、发展，有助于及早发现子痫前期的高危孕妇，并及时给予监护和处理，从而降低孕产妇及围生儿病死率，但现今尚缺乏预测子痫前期发生的相对有效且无创的指标[2]。目前，多项研究发现子痫前期孕妇血浆中胎儿游离核酸的水平可在一定程度上预测子痫前期的发生。而超甲基化的Ras相关区域家族1A(RASSF1A)基因是胎儿特有的表观遗传学标志物，可能在预测子痫前期的发生中具有一定的价值，但尚需进一步的临床研究[3－4]。为此，本研究检测了孕中期孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因表达水平，旨在探讨其在预测子痫前期发生中的应用价值，现报告如下。

对象与方法

一、研究对象

选择2012年1月至2013年12月在我院规律产前检查的506例孕妇，分别于孕15～19周及孕20～24周采外周血，同时监测孕妇血压、尿蛋白值，其中诊断为妊娠期高血压疾病96例孕妇，包括子痫前期孕妇48例 (子痫前期组)、妊娠期高血压孕妇48例 (妊娠期高血压组)。入组标准:①单胎;②年龄18～45岁;③符合第7版《妇产科学》子痫前期或妊娠期高血压的诊断标准[5]。选取同期18～45岁的96名单胎健康孕妇为对照组。各组孕妇年龄、产次、孕前BMI比较差异均无统计学意义 (P均＞0.05)，见表1。子痫前期组孕妇分娩孕周及新生儿出生体质量均低于妊娠期高血压组及对照组，比较差异均有统计学意义 (P＜0.05)，见表1。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

表1 各组孕妇一般情况比较

二、方 法

1.样本采集

抽取研究对象空腹肘静脉血4 ml放入依地酸二钠抗凝管中，离心分离血浆，置－80°C冰箱冻存备用。

2.血浆中胎儿游离DNA的提取

取待检血浆1 ml，采用德国Qiagen公司提供的QIAamp Blood Mini kit试剂盒，按照说明书的操作步骤从血浆中提取游离DNA。

3.甲基化敏感的限制性内切酶消化

在0.5 ml的EP管中建立以下体系:模板DNA 25 μl，HinP1 I内切酶 20 U，Hha I内切酶 20 U(美国New England Biolabs公司)，10倍稀释的NE Buffer 5 μl加入双蒸水至 50 μl，充分混匀，于37℃水浴16 h。

4.荧光定量PCR检测

使用FTC－2000实时荧光定量PCR仪 (加拿大Funglyn Biotech公司)，依次扩增酶切前后的RASSF1A基因及β－肌动蛋白 (β－actin) 基因。参考NCBI GenBank数据库中RASSF1A基因序列，采用Primer 5.0软件设计引物及探针。RASSF1A正向引物序列为 5'－GACCTCTGGCGACTTCATCTG－3'，反向引物序列为 5'－GACCTAGTCCTCGGGAGC TGTC－3'，探针序列为 5'－FAM－CCCTCTGCCGCGACTTGACCCGT TAMRA－3'，扩增片段长度为 173 bp;内参照选用β－actin基因，正向引物序列为5'－TGGACATCTCTTGGGCA CTGA－3'，反向引物序列为 5'－CAACACCACACTCTACCTCTCAA－3'，探针序列为 5'－FAM－TCTCCCTAGTGACCCACCCAGCACATAMRA－3'，扩增片段长度为262 bp。以上引物及探针均由上海生物工程公司合成。反应条件及体系如下:酶切后模板 DNA 20 μl(相当于酶切前 10 μl)，Premix Ex TaqTM25 μl(日本 TaKaRa 公司)，10 μmol/L 探针 1.0 μl，10 μmol/L 引物各 1.5 μl，加入双蒸水至总体积达50 μl。RASSF1A基因:95℃ 3 min预变性;45个循环 (94℃ 20 s;60℃20 s;72℃ 30 s)，每个循环结束时PCR仪自动检测1次荧光值;72℃ 4 min延伸。β－actin基因:95℃ 3 min预变性;45个循环 (94℃ 30 s;60℃30 s;72℃ 30 s)，每个循环结束时PCR仪自动检测1 次荧光值;72°C 4 min 延伸。采用 2－△△ct法计算其表达水平。

三、统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。正态分布的计量数据以表示，多组间均数比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK－q检验;非正态分布的计量资料以中位数和上、下四分位数 [M(P25～P75)]表示，多组间均数比较采用Kruskal－Wallis检验。计数资料的组间比较采用χ2检验。总体比较以P＜0.05为差异有统计学意义;计数资料组间两两比较，以P＜0.05/3=0.017为差异有统计学意义。

结 果

一、随访结果

剔除失访及随访中出现各种异常不再适合入组的孕妇，共506例孕妇参与本研究。在妊娠20周后陆续发展为子痫前期的孕妇48例，其中在妊娠34周前发展为子痫前期的孕妇有20例，本次调查中子痫前期的发病率为9.4%，早发型子痫前期(孕34周前发病)的发病率为3.9%，其临床症状出现在24～38周。子痫前期组孕妇的分娩孕周较短，新生儿体质量较轻 (P均＜0.05)，见表1。

表1 妊娠期高血压疾病孕妇与对照组孕妇的分娩孕周及新生儿体质量比较 ()

表1 妊娠期高血压疾病孕妇与对照组孕妇的分娩孕周及新生儿体质量比较 ()

注:与子痫前期组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组 别 例数 分娩孕周(周)新生儿体质量(g)48 34±6 2209±978妊娠期高血压组 48 38±3a 3123±419a对照组 96 39±3b 3012±593b F值 7.778 10.06 P值子痫前期组0.001 ＜0.001

二、妊娠期高血压疾病孕妇与对照组孕妇血浆中RASSF1A基因及β-actin的检出情况

在甲基化敏感的限制性内切酶消化前，48例子痫前期组、48例妊娠期高血压组及96例健康对照组在2个检测阶段均能检测到RASSF1A基因及β－actin。酶切后在15～19周有4例受检者未检测到RASSF1A基因 (子痫前期组1例，妊娠期高血压组1例，对照组2例)，在20～24周有2例未检测到RASSF1A基因 (妊娠期高血压组、对照组各1例)，所有孕妇均未检测到β－actin。

三、妊娠期高血压疾病孕妇与对照组孕妇不同阶段外周血中超甲基化RASSF1A基因表达水平比较

孕15～19周时子痫前期组超甲基化RASSF1A基因水平高于对照组 (Z=2.614，P=0.009);妊娠期高血压组超甲基化RASSF1A基因水平高于对照组 (Z=2.482，P=0.013);子痫前期组与妊娠期高血压组比较差异无统计学意义 (Z=1.850，P=0.064)。孕20～24周时子痫前期组超甲基化RASSF1A基因表达水平高于对照组 (Z=3.093，P=0.002);妊娠期高血压组超甲基化RASSF1A基因水平高于对照组 (Z=2.584，P=0.010);子痫前期组的超甲基化RASSF1A基因水平高于妊娠期高血压组 (Z=2.753，P=0.006)，见表2。

讨 论

子痫前期是一种累及全身多器官的妊娠期特发性疾病，常发生于妊娠中晚期，其临床表现主要为母体综合征，包括高血压病和蛋白尿伴或不伴有多系统的功能障碍[6]。目前预测其发病的常用方法有MAP测定、翻身试验、血液流变学试验、尿酸及某些生化指标测定，但效果均欠佳。因此，寻找一种能在子痫前期发病前即对其做出预测的有效、无创、特异的诊断方法显得尤为重要。

多数学者认为子痫前期的病理变化开始于胎盘形成阶段。其发病主要是由于孕早期胎盘滋养细胞侵入不足，导致胎盘缺血、缺氧，进入母血中的胎儿成分增加。1999年Lo等研究证实，子痫前期的发生与母血中胎儿游离DNA存在相关性，并推测此种DNA可作为子痫前期的早期预测指标。此后，多项研究也得出与Lo相似的结论。但其对胎儿游离DNA的检测都是通过测定Y染色体特异性的序列 DYS14、SRY 实现[7－8]。因此，该方法对子痫前期的预测只局限于妊娠男胎的人群，限制了其应用。

表2 各组超甲基化RASSF1A基因水平的比较 [M(P25～P75)]

DNA甲基化为基因沉默的一种方式 ，是较早发现的基因表观修饰方式之一，也是最常见的复制后调节方式[9]。近年来，随着表观遗传学的发展，借助DNA甲基化检测方法进行无创性产前诊断成为可能，且不受胎儿性别影响。Bellido等[10]研究发现位于3号染色体的RASSF1A基因在胎盘与母血间具有不同的甲基化状态，胎盘源性超甲基化RASSF1A具有胎儿DNA特点，可作为胎儿遗传标志物应用于产前诊断领域。Kim等[11]研究发现包括胎儿宫内生长受限、子痫前期、前置胎盘在内的胎盘功能不全孕妇血浆中胎盘源性超甲基化RASSF1A表达水平明显升高。Papantoniou等[12]研究发现，子痫前期孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因表达水平明显高于正常孕妇，且具有较高的敏感性及特异性。本研究显示，子痫前期及妊娠期高血压孕妇孕15～24周血浆中超甲基化RASSF1A水平高于正常孕妇，其结果的获得早于孕24～38周临床表现的出现，提示其可能成为预测子痫前期发病的新指标，具有一定的临床应用价值。子痫前期孕妇血浆中胎儿游离DNA增加可能源于以下两方面，一是胎盘滋养细胞侵入不足，胎盘屏障受损，导致胎儿游离DNA进入母血中增加，二是子痫前期孕妇的肝脏及肾脏功能都不同程度受到损害，使其对DNA清除能力下降[13]。本研究显示孕20～24周子痫前期孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因水平高于妊娠期高血压孕妇，可能是因为妊娠期高血压发展到子痫前期是疾病进展的过程，而子痫前期孕妇的胎盘屏障及肝肾功能的损害程度高于妊娠期高血压孕妇。

子痫前期孕妇胎盘的病理改变发生在孕20周前，而其临床症状多出现在孕24～38周，本研究应用表观遗传学方法检测了孕15～24周子痫前期、妊娠期高血压及正常孕妇血浆中超甲基化RASSF1A基因水平，提示其水平变化与子痫前期发病有关。跟踪检测其水平变化，或许有助于及早发现子痫前期高危孕妇，如给予相应的处理，可能在一定程度上改善妊娠结局。

[1]Duley L.The global impact of pre－eclampsia and eclapsia.Semin Perinatol，2009，33(3):130－137.

[2]Wald NJ，Bestwick JP，George LM，Wu T，Morris JK.Screening for preeclampsia using serum placental growth factor and endoglin with Down's syndrome Quadruple test markers.J Med Screen，2012，19(2):60－67.

[3]Hahn S，Huppertz B，Holzgreve W.Fetal cells and cell free fetal nucleic acids in maternal blood:new tools to study abnormal placentation.Placenta，2005，26(7):515－526.

[4]Orozco AF，Jorgez CJ，Ramos－Perez WD，Popek EJ，Yu X，Kozinetz CA，Bischoff FZ，Lewis DE.Placental release of distinct DNA－associated micro－particles into maternal circulation:reflective of gestation time and preeclampsia.Placenta，2009，30(10):891－897.

[5]乐杰.妇产科学.北京:人民卫生出版社，2008:92－98.

[6]Redman CW，Sargent IL.Placental stress and preeclampsia:a revised view.Placenta，2009，30(SupplA):S38－S42.

[7]Sikora A，Zimmerman BG，Rusterholz C，Birri D，Kolla V，Lapaire O，Hoesli I，Kiefer V，Jackson L，Hahn S.Detection of increased amounts of cell－free fetal DNA with short PCR amplicons.Clin Chem，2010，56(1):136－138.

[8]Scheffer PG，van der Schoot CE，Page－Christiaens GC，Bossers B，van Erp F，de Haas M.Reliability of fetal sexdetermination using maternal plasma.Obstet Gynecol，2010，115(1):117－126.

[9]郑伏甫，戴宇平，徐理华，邓春华，郑克立.肾癌组织中BHD、RASSF1A、SPINT2基因启动子的甲基化研究.新医学，2010，41(6):358－361.

[10]Bellido ML，Radpour R，Lapaire O，De Bie I，Hösli I，Bitzer J，Hmadcha A，Zhong XY，Holzgreve W.MALDI－TOF mass array analysis of RASSFIA and SERPINB5 methylation patterns in human placenta and plasma.Biol Reprod，2010，82(4):745－750.

[11]Kim MJ，Kim SY，Park SY，Ahn HK，Chung JH，Ryu HM. Association of fetal－derived hypermethylated RASSF1A concentration in placenta－mediated pregnancy complications.Placenta，2013，34(1):57－61.

[12]Papantoniou N，Bagiokos V，Aqiannitopoulos K，Kolialexi A，Destouni A，Tounta G，Kanavakis E，Antsaklis A，Mavrou A.RASSF1A in maternal plasma as a molecular marker of preeclampsia.Prenat Diagn，2013，33(7):682－687.

[13]Litton C，Stone J，Eddleman K，Lee MJ.Noninvasive prenatal diagnosis past，present，and future.Mt Sinaj J Med，2009，76(6):521－528.