癃畅颗粒对大鼠前列腺增生组织凋亡调控基因fas表达的影响*

杨珊珊 安立文 柳文宏. 黑龙江中医药大学研究生（哈尔滨 50040）；2.黑龙江中医药大学附属第一医院泌尿外科； . 江苏淮安市第四人民医院

癃畅颗粒对大鼠前列腺增生组织凋亡调控基因fas表达的影响*

杨珊珊1安立文2**柳文宏3
1. 黑龙江中医药大学研究生（哈尔滨 150040）；
2.黑龙江中医药大学附属第一医院泌尿外科； 3. 江苏淮安市第四人民医院

目的 通过癃畅颗粒对大鼠前列腺增生组织凋亡调控基因fas表达的影响，探讨癃畅颗粒治疗前列腺增生的作用机制。方法 Wistar雄性大鼠120只，随机平均分为癃畅颗粒高、中、低剂量组，癃闭舒组，模型组和正常组6组，每组20只。除正常组外，其余各组采用大鼠去势后注射Testosterone Propionate（丙酸睾酮）至前列腺增生法造模，各组均灌胃给药30d后处死，摘取前列腺组织测量湿质量，计算前列腺指数，采用免疫组化PV法检测实验鼠前列腺增生组织Fas表达状况。结果 （1）前列腺湿重：正常组（0.62±0.91）g；模型组（0.92±0.50）g；癃闭舒组（0.75±0.58）g；癃畅颗粒低剂量组（0.80±0.92）g；癃畅颗粒中剂量组（0.79±0.10）g；癃畅颗粒高剂量组（0.64±0.71）g；与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）前列腺指数：正常组（0.142±0.061），模型组（0.225±0.064），癃闭舒组（0.168±0.092），癃畅颗粒低剂量组（0.199±0.047），癃畅颗粒中剂量组（0.182±0.036），癃畅颗粒高剂量组（0.167±0.039），与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）癃畅颗粒对良性前列腺增生大鼠前列腺上皮细胞fas基因表达影响（平均光密度）：正常组（0.216±0.029），模型组（0.183±0.089），癃闭舒组（0.201±0.129），癃畅颗粒低剂量组（0.200±0.126），癃畅颗粒中剂量组（0.202±0.143），癃畅颗粒高剂量组（0.207±0.177），与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 癃畅颗粒能够上调大鼠前列腺组织fas表达，缩小模型大鼠前列腺湿质量，减轻病理变化，这可能是该药临床有效治疗前列腺增生症的作用机制之一。

癃畅颗粒； 前列腺增生； 细胞凋亡； fas基因

良性前列腺增生（BPH）是老年男性常见疾病，其导致的排尿困难和并发症严重影响患者生活质量，给患者带来诸多困扰及痛苦。BPH的发病率随年龄而增长，40～49岁时发生率为1.2%，到60岁时大于50%，80岁时高达83%［1］。BPH手术治疗疗效明显，但有一定程度的损伤和并发症。中药治疗BPH具有悠久的历史和良好的疗效，中药癃畅颗粒是我院临床治疗前列腺增生症的经验方，疗效明显。为了进一步探讨癃畅颗粒的作用机制，选择Wistar大鼠制成BPH模型进行药物干预，观察癃畅颗粒对模型大鼠前列腺增生组织凋亡调控基因fas表达的影响，进一步探讨癃畅颗粒治疗BPH的作用机制，现报告如下。

材料与方法

一、试验药物及配制

癃畅颗粒由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室制剂，主要成分为：炙黄芪、党参、牛膝、山萸肉、莪术、皂刺、车前子、瞿麦等。癃闭舒胶囊为石家庄科迪药业有限公司生产，主要成分为：补骨脂、益母草、金钱草、海金沙、琥珀、山慈菇；批准文号为国药准021203024；丙酸睾酮注射液为上海通用药业股份有限公司生产，批准文号为：沪卫字（1995）第009001号。

二、实验动物

Wistar雄性大鼠120只，体质量（350±20）g。由黑龙江中医药大学实动物中心提供，合格证号为黑动字第P00102004号。专用鼠饲料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号为黑动字第P00305007号。

三、主要试剂

大鼠fas兔抗兔抗鼠fas多克隆抗体（武汉博士德生物有限公司提供）。PV-6001二步法试剂盒、DAB显示剂检测试剂盒（北京中山生物有限公司提供）。

四、造模与分组

将大鼠普通饲养1周以适应环境，并经观察无异常后，随机取20只作正常组，其余100只进行造模。造模方法按文献［2］并稍做改进。将100只大鼠随机分为模型组、癃必舒组、癃畅颗粒低剂量组（简称癃畅低组）、癃畅颗粒中剂量组（简称癃畅中组）、癃畅颗粒高剂量组（简称癃畅高组），每组20只。先用戊巴比妥那麻醉后，常规消毒皮肤，经阴囊摘除双侧睾丸，残端处结扎以确保止血，缝合肌肉、皮肤。术后恢复7d，自术后第8天起，除正常组外所有大鼠均经皮下注射丙酸睾酮5mg/kg，1次/d，连续15d。

五、给药剂量及方法

从去势术后第8天起，开始灌胃给药［3］。癃必舒组剂量为4.42g/（kg•d）（相当于临床等效剂量的20倍），癃畅颗粒低、中、高3个剂量依次为3.33 g/ （kg•d）（相当于临床量的10倍）、5.00 g/（kg•d）（相当于临床量的15倍）、6.67 g（kg•d）（相当于临床量的20倍），连续给药，正常组和模型组每日灌胃给等量生理盐水1次。

六、取材与制样

各组大鼠分别在给药后第30天时处死，摘除前列腺各叶。电子天秤称体质量及前列腺湿质量（以g为单位精确到0.01g），计算前列腺指数（前列腺指数=前列腺湿质量/体质量）。经10%甲醛溶液固定，常规脱水二甲苯透明，浸蜡包埋，以备切片用，HE染色。

七、免疫组化染色

石蜡切片常规脱蜡至水；3%H2O2孵育10min封闭灭活内源性过氧化酶；微波修复抗原：将切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，放置在微波炉中加热5min×2次，间隔10min，冷却至室温；0.1mol/LPBS（磷酸盐缓冲液）洗涤，3min×3次；滴加1∶50兔抗IgG，37℃孵育2h；PBS洗3min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP结合体，37℃孵育20min；PBS洗3min×3次；DAB二氨基联苯- H2O2室温避光显色5～10min，自来水充分冲洗；轻度复染，逐级乙醇脱水、透明、中性树胶封片，Motic-BA400显微镜，于40倍视野下摄影，每组每张切片随机选取5个视野，用Moticimage3.2图像分析软件进行分析，计算平均面密度（细胞阳性表达面积与视野总面积百分比）比和光密度（细胞阳性表达强弱）。

八、统计学分析

结 果

一、各组大鼠体质量、前列腺湿质量、前列腺指数的比较

各组大鼠体质量差异无显著性，各组间具有可比性。模型组前列腺湿质量及指数明显高于正常组（P ＜0.01），说明造模成功。与模型组比较，癃畅低、中、高组前列腺湿质量及指数明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05和P＜0.01）；与癃闭舒组比较，癃畅中组前列腺湿重及指数均明显下降，差异有显著性（P＜0.01和P＜0.05）；癃畅高组前列腺湿质量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；癃畅高组前列腺指数与癃闭舒组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；癃畅低组与癃闭舒组比较，前列腺湿质量、指数，差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表1。

二、各组大鼠前列腺组织fas的表达

Motic-BA400显微镜，于40×视野下摄影，每组每张切片随机选取5个视野，用Moticimage3.2图像分析软件进行分析，计算平均面密度（细胞阳性表达面积与视野总面积百分比）和光密度（细胞阳性表达强弱）。fas基因阳性表达呈棕黄色，主要表达腺上皮泡质中。正常组阳性表达面积及强度最明显，模型组表达最低。癃畅颗粒高、中、低剂量组fas的阳性表达均高于模型组。经比较有显著性差异（P＜0.01和P＜0.05），高剂量组与癃闭舒组比较无显著性差异（P＞0.05），结果见表2。

三、各组大鼠前列腺组织病理变化

正常组大鼠前列腺腺泡上皮呈单层柱状或假复层，腺腔内有少量酸性分泌物，腺上皮细胞核圆形，位于基底部，核仁明显。模型组大鼠整个视野内腺腔充满，上皮细胞多呈高柱状或立方状，常可见细胞肥大扭曲，排列紊乱，细胞间隙增宽，间质中纤维组织增生，以胶原纤维为主。细胞中线粒体肿胀，嵴变少。癃畅高、中组见腺腔明显减少，管腔细胞多为单层柱状排列，细胞皱缩，间质少而疏松。癃畅低组与癃必舒组管腔细胞单复层均有出现，上皮细胞多呈高柱状或立方状，乳头状结构明显减少。经治疗后，各组病理变化较模型组均有不同程度改善，其中以高剂量组改善明显。

表2 癃畅颗粒对BPH大鼠前列腺上皮细胞fas表达的影响（）

表2 癃畅颗粒对BPH大鼠前列腺上皮细胞fas表达的影响（）

与正常组比较: *P＜0.05， **P＜0.01； 与模型组比较， ▲P＜0.05，▲▲: P＜0.01； 与癃闭舒组比较， #P＜0.05， ##P＜0.01

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表1 癃畅颗粒对BPH大鼠前列腺湿质量及前列腺指数的影响（n=20，）

表1 癃畅颗粒对BPH大鼠前列腺湿质量及前列腺指数的影响（n=20，）

与正常组比较: *P＜0.05， **P＜0.01； 与模型组比较， ▲P＜0.05，▲▲: P＜0.01； 与癃闭舒组比较， #P＜0.05， ##P＜0.01

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讨 论

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia BPH）是老年男性常见疾病，随着我国人民生活水平的提高和平均寿命的延长，BPH的发病率迅速增长［4］，其引起膀胱颈梗阻，出现排尿异常症状，最终引起膀胱及肾脏病变，严重影响老年人的生活质量。目前在药物治疗BPH的研究中，植物制剂因疗效确切，适合长期服用且安全无毒符合本病特点，而日益受到重视。BPH在中医学中属“癃闭”范畴。多因年老体弱或久病体虚，劳损肾精，膀胱气化无力而导致排尿无力。气化失常，浊阴不降，久病必瘀，痰瘀互结，积而成块，压迫尿道而致。《景岳全书•癃闭》所云：“或以败精，或以槁血，阻塞水道而不通也”。同时还由于湿浊运化不利而淤滞，湿淤日久化热而出现湿热下注，故属本虚标实之证，治宜标本同治，虚实兼顾，“以通为用”，消补并施。以补肾益气、活血祛瘀、利湿通淋为基本大法，癃畅颗粒就是依据这一基本理论筛选优化而组成的治疗BPH的临床经验方。方中炙黄芪、党参、山萸肉补肾益气，养血行瘀；莪术、牛膝、皂刺活血祛瘀、化积消癥；车前子、瞿麦通闭利小便；川牛膝引血下行，引导诸药直达病所，诸药合用，切中病机。临床研究证实［5］该药有较好的减轻BPH患者排尿异常症状，缩小前列腺体积，改善尿流率参数作用。

众多研究表明，正常前列腺的大小能保持恒定主要是因为腺体内细胞的增殖与凋亡保持平衡的结果，细胞增殖与凋亡异常是发生BPH的重要原因之一。前列腺增生时由于前列腺组织中各种基因、生长因子等表达水平发生改变，表现为细胞复制增加和（或）细胞死亡数目减少，从而引起总的细胞数目增加，导致前列腺体积增大。BPH的发生细胞死亡的减少可能更为重要［6］。fas广泛分布于各种组织细胞内，并参与一系列生理过程［7］。fas是一种属于神经生长因子受体超家族成员的膜受体蛋白，在细胞凋亡过程中起信号传导作用，诱导表达fas蛋白的细胞发生凋亡［8］。fas能激活至少两个独立的通路，并且这两种通路间存在部分共有信号分子：（1）由fas受体所主导，通过与三聚化的fasL结合而被激活，激活后的fas可以通过下游的接头蛋白FADD与caspase-8等蛋白形成死亡诱导复合物（death inducing signaling complex，DISC）构成fas信号通路的核心，激活的DISC 复合物通过Caspase-8激活下游的Caspase家族，剪切Caspase-3， 从而引发细胞凋亡［9-11］；（2）在死亡受体fas介导的凋亡途径中，DISC催化裂解Bcl-2家族成员Bid前体，形成截断型激活型Bid（trun-cated Bid， tBid），激活的tBid转位到线粒体，触发bak和bax同源寡聚作用，启动细胞色素C的释放， 启动细胞凋亡［12］。本实验结果显示， BPH组织中fas表达显著低于正常前列腺组织，癃畅颗粒高、中、低剂量组fas的阳性表达均高于模型组，提示fas表达减少可能是导致前列腺细胞凋亡减少，进而促使BPH形成的原因之一，癃畅颗粒上调fas基因的表达可能是其临床有效治疗前列腺增生的机制之一。

我们的前期研究亦发现［13-16］，癃畅颗粒具有下调前列腺组织bcl-2基因和上调bax基因表达作用，结合本组实验上调fas基因的表达的结果推测，癃畅颗粒可能具有调控部分前列腺组织细胞增殖与凋亡基因作用，从而实现减轻实验大鼠的前列腺湿质量、体积，抑制前列腺组织细胞的增生作用。中药现代药理研究显示，癃畅颗粒组方中黄芪、党参、莪术、牛膝、皂刺等多味中药，无论是单独作用还是组方，对包括bax、fas bcl-2等在内的多种凋亡调控基因的表达都有调控作用［17-21］。

综上所述，癃畅颗粒作为临床治疗前列腺增生症的有效方剂，其作用机制之一可能是通过调控前列腺组织相关凋亡基因的表达，促进前列腺组织细胞凋亡，从而达到抑制组织增生，缩小前列腺体积，改善临床症状的目的。

1 Embertom M， Andriole GL， de la Rosette J， et al. Bening Prostatic hyperplasia: aprogressine disease of aging men. Urology 2003； 61（2）:267-273

2 中华人民共和国卫生部药政局. 新药（西药）临床前研究指导原则汇编. 北京: 人民卫生出版社， 1993； 101-103

3 贾金铭， 马春涛， 王勒渝， 等. 中药消癃通闭对大鼠前列腺平滑肌一氧化氮合酶及上皮细胞凋亡的影响. 中国中西医结合杂志 2002； 22（3）:196-199

4 顾方六. 现代前列腺病学. 北京: 人民军医出版社， 2002； 2

5 安立文， 高山， 马明，等. 癃畅颗粒治疗良性前列腺增生症30例. 环球中医药 2015； 8（6）: 757-759

6 Coffey DS， Ripoll E， Sugimura Y， et al. Animal models of benign prostatic hyperplasia.In Codkett ATK，Aso Y，Chatelain C， et al（eds）. The intemational consultation on benign prostatic hyperplasia（BPH）. Paris 1999； 45 （3）: 271-275

7 黄旭元， 易彬， 陈斌， 等. BPH患者膀胱逼尿肌细胞凋亡及Fas、FasL表达的研究. 中国男科学杂志 2005； 19（6）: 18-21

8 Nagata S， Golstein P. The Fas death factor. Science 1995； 267（5203）: 1449-1456

9 Wajant H. The Fas signaling pathway: more than aparadigm. Science 2002； 296（5573）: 1635-1636

10 Harper N， Hughes M， MacFarlane M， et al. Fas-associat-ed death domain protein and caspase-8 are not recruited tothe tumor necrosis factor receptor 1 signaling complexduring tumor necrosis factor-induced apoptosis. J Biol Chem 2003； 278（28）: 25534-25541

11 Krammer PH.CD95（APO-1/Fas）-mediated apoptosis: live and let die. Adv Immunol 1999； 71: 163-210

12 Kandasamy K， Srinivasula SM， Alnemri ES， et al. Involvement of proapoptotic molecules Bax and Bak in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced mitochondrial disruption and apoptosis: differential regulation of cytochrome c and Smac/DIABLO release. Cancer Res 2003； 63（7）: 1712-1721

13 安立文， 张敏道， 赵勇宁. 癃畅颗粒对大鼠前列腺增生组织bcl-2基因表达影响的研究. 中国男科学杂志2009； 23（10）: 31-34

14 赵勇宁， 安立文， 李松涛， 等. 癃畅颗粒对睾酮诱导的大鼠前列腺增生组织bax表达影响的研究. 中华男科学杂志 2009； 15（2）: 182-186

15 刘洋， 安立文.中医药治疗良性前列腺增生机理的研究进展与现状.中国男科学杂志 2006； 20（6）: 71-72

16 王德明， 谢红， 王国政.糖尿病大鼠阴茎海绵体细胞凋亡与Bcl-2和Bax基因表达. 中华男科学杂志 2004；10（11）: 844-848

17 李琦， 温进坤， 韩梅. 黄芪和当归对血管平滑肌细胞表型标志基因表达和细胞增殖的影响. 中国动脉硬化杂志 2004； 12（2）: 147-150

18 王若光， 尤昭玲， 李春梅， 等. 黄芪丹参复方成分对一氧化氮合成阻滞孕鼠胎盘细胞凋亡调控基因（bcl-2/Bax）蛋白影响研究. 中国实验方剂学杂志 2005； 11（5）: 44-46

19 李东涛， 孙桂芝， 裴迎霞， 等. 益气活血软坚解毒方含药血清诱导人肝癌细胞系Bel-7402细胞凋亡过程中部分凋亡调控基因变化. 世界华人消化杂志 2006； 14（36）: 3443-3449

20 苏巧珠， 李海刚.中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究进展. 中药材 2000； 23（8）: 500-503

21 蔡文清， 黎玮， 张勇， 等. 中药对小鼠前列腺细胞增殖及凋亡的影响. 中华泌尿外科杂志 2004； 25（5）: 328-330

（2015-03-24收稿）

The effects of Longchang Granule on the expression of apoptosis gene Fas in prostate tissues of rats with benign prostatehyperplasia*

Yang Shanshan1， An Liwen2**， Liu Wenhong3
1. Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China； 2. Department of Urology， the First Hospital of
Heilongjian University of Chinese Medicine； 3 .HuaianFourth People's Hospital

An Liwen， E-mail:anlw007@aliyun.com

Objective To observe the effects of Longchang particles on apoptosis genes fas in prostatic hyperplasia tissues and explore its mechanism in the treatment of benign prostatic hyperplasia. Methods Total of 120 Wistar male rats were randomly divided into six groups including high-dose Longchang group， the medium-dose Longchang group， the low-dose Longchang group， Longbishu group， the model group and the normal group， and 20 rats in each group. In addition to the normal group， rats in the rest of the group were ovariectomized and then injected with Testosterone Propionate （ TP ）to establish the rat models with benign prostatic hyperplasia. Subsequence， the rats were intragastrically administrated with Longchang particles for 30 days. They were sacri ced and their prostate tissues were collected for wet weight measurement，expression of Fas gene. Results Prostate wet weight of the normal group was （0.62±0.91） g， the model group （0.92±0.50）g， Longbishu group （0.75±0.58） g， Longchang Granule of low -dose group （0.80±0.92） g， Longchang Granule of mediumdose group （0.79±0.10） g， Longchang Granule of high -dose group （0.64±0.71） g； with signi cant differences between the model and the intervention groups（P＜0.05）. Prostate index: the normal group （0.142±0.061）， the model group （0.225±0.064），Longbishu group （0.168±0.092）， Longchang Granule of low -dose group （0.199±0.047）， Longchang Granule of mediumdose group （0.182±0.036）， Longchang Granule of high-dose group （0.167±0.039）， with significant differences between the model and the intervention groups （P＜0.05）. Longchang particles Fas gene expression in epithelial cell proliferation in rat prostate （mean optical density） for benign prostatic: the normal group（0.216±0.029）， the model group（0.183±0.089），Longbishu group （0.201±0.129）， Longchang Granule of low -dose group（0.200±0.126）， Longchang Granule of medium -dose group（0.202±0.143）， Longchang Granule of high -dose group （0.207±0.177）， with signi cant differences between the model and the intervention groups （P＜0.05）. Conclusion Longchang particles can be signi cantly decreased prostate wet weight， ameliorated the pathological changes， upregulated Fas expression which may explain its role in treatment of benign prostatic hyperplasia.

Longchang Granule； prostatic hyperplasia； apoptosis； fas gene

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.005

R 697.32

*资金项目资助: 教育部春晖计划基金资助（基金标号：Z2010043）

**通讯作者， E-mail:anlw007@aliyun.com