前泌通片基于Th1/Th2细胞平衡对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的作用机理研究*

李广森 常德贵， 张培海 尤耀东 钟振东俞旭君 陈帝昂 安志涛 梅雪峰 蔡 剑** 毕明帅**.成都中医药大学附属医院男科（成都 6007）； . 成都中医药大学第二附属医院男科；.四川省中西医结合医院； . 成都中医药大学； . 四川省人民医院病理科

前泌通片基于Th1/Th2细胞平衡对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的作用机理研究*

李广森1常德贵1，2张培海3尤耀东4钟振东5
俞旭君2陈帝昂1安志涛4梅雪峰1蔡 剑1**毕明帅1**
1.成都中医药大学附属医院男科（成都 610072）； 2. 成都中医药大学第二附属医院男科；
3.四川省中西医结合医院； 4. 成都中医药大学； 5. 四川省人民医院病理科

目的 探究基于Th1/Th2细胞平衡前泌通片对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的治疗作用机理。方法 60只SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、前泌通片低中高剂量组，每组10只。除空白组，余各组建立慢性非细菌性前列腺炎模型。建模成功后，阳性对照组给予前列通瘀胶囊混悬液灌胃，前泌通片低中高剂量组分别给予不同剂量前泌通混悬液灌胃，空白组给予生理盐水灌胃，连续灌胃4周，末次给药后24h，股动脉放血处死大鼠，光镜下观察前列腺组织病理改变，免疫组化法检测IFN-γ和IL-4并计算IFN-γ/IL-4比值。结果 与模型组比，前泌通片高中剂量组组织炎症明显减轻，前泌通片高剂量组IFN-γ和IL-4含量显著降低（P＜0.01），前泌通片中低剂量组IL-4含量显著降低（P＜0.01），前泌通片高中低剂量组IFN-γ/IL-4比值显著升高（P＜0.01）。结论 前泌通片可减轻慢性非细菌性前列腺炎大鼠组织炎症和下调IFN-γ、IL-4含量，上调IFN-γ/IL-4比值。

前泌通片； 前列腺炎； Th1细胞； Th2细胞

慢性前列腺炎（ChronicProstatitis，CP）是男性常见疾病，发病率在6.0%～ 32.9%之间［1］，其中慢性非细菌性前列腺炎（Chronic abacterial prostatitis，CAP）约占前列腺炎综合征的90%～95%，其病因和发病机制尚不明确［2］，故西医治疗效果不明显。近年来的研究表明，中医药在该病的治疗中发挥着越来越重要的作用［3，4］。有研究显示，自身免疫和T细胞增殖反应可能参与了CAP的发病过程，较多地关注免疫因素与前列腺炎的关系［5］。CAP中医学多从湿热、瘀阻、肾虚论治，关于CAP证型调查显示，气滞血瘀证、肝气郁结证和湿热下注证的出现频率较多［6］，且多合并出现，故治疗上多以理气活血、清热利湿通淋为主。前泌通片（原名增瀑颗粒）正是在上述治则的指导下，经我科多年临床经验总结，由天台乌药散加减化裁而来。经临床观察显示，前泌通片治疗CAP疗效满意，对疼痛症状的改善尤为突出［7］。本实验通过研究前泌通片对炎性因子IFN-γ和IL-4的调控进一步影响Thl/Th2细胞的平衡以及病理变化来探讨前泌通片对治疗CAP的免疫机制。

材料与方法

一、材料

（一）实验药物

前列通瘀胶囊生产单位：珠海星光制药有限公司，国药准字219990060。

前泌通片生产单位：成都中医药大学附属医院，川药制字：Z20070658。

（二）实验动物

选取10～12月龄健康雄性、清洁级SD大鼠60只，体重300～400g，由成都中医药大学动物实验中心（川实动管127号）提供，常规驯养1周。

（三）仪器及试剂

日本OLYMPUS生物显微镜、-80℃低温冰箱、低温离心机、恒温水浴锅、MicromHM 340E 石蜡切片机等。IFN-γ免疫组化一抗、IL-4免疫组化一抗，由北京博奥森生物技术有限公司提供。

二、方法

（一）实验分组

将60只雄性SD大鼠，正常喂养1周，随机分为6组：空白对照组（空白组）、CAP模型组（模型组）、CAP+前列通瘀胶囊组（阳性对照组）、CAP+前泌通片低剂量治疗组（低剂量组）、CAP+前泌通片中剂量治疗组（中剂量组）、CAP+前泌通片高剂量治疗组（高剂量组），每组各l0只。

（二）实验造模

依据魏武然［8］建立的CAP大鼠动物模型造模。具体方法是：模型组、对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠均用25%乌拉坦按1g/Kg量，经腹腔注射麻醉，无菌条件下做去势手术，术后放回鼠笼，密切观察。于术后第2天皮下注射苯甲酸雌二醇0.25mg/kg，qd，连续30d。空白组不做任何处理，正常喂养。

（三）给药方法

在最后一次皮下注射苯甲酸雌二醇后第2天，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予1.9g/kg•d-1、3.8g/kg•d-1、7.6g/kg•d-1（分别相当于推荐临床试验70kg成人日用剂量的5倍、l0倍、20倍）前泌通片灌胃；对照组给予前列通瘀胶囊3.9g/kg•d-1（相当于临床试验70kg成人日用剂量的20倍）灌胃；空白组给予灌服0.9%的生理盐水。采用等容积不等浓度药液法给药，0.1ml/10g体重连续用药4周。

（四）标本采集

末次给药后24h，股动脉放血处死大鼠，剖取大鼠前列腺左叶迅速放置于10%福尔马林液固定，24h后作冠状面取材，石蜡包埋，以备切片用。另取部分组织与-80℃保存待测。

（五）组织病理学检查

取部分前列腺组织经福尔马林固定，石蜡包埋切片，常规S-P染色，光镜下观察大鼠前列腺腺腔及间质的炎性细胞浸润情况。阳性表现：炎症细胞内出现黄色或棕黄色颗粒。

（六）检测指标及方法

前列腺组织IFN-γ和IL-4蛋白表达：采用免疫组织化学法对前列腺组织IFN-γ和IL-4蛋白表达进行检查并计算IFN-γ/IL-4比值。

（七）统计方法

结 果

一、病理学检查结果

镜下观察结果空白组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构完整，腺泡上皮为单层柱状或立方上皮，腺腔内散在分布有棕黄色的炎性分泌物，间质内偶见少量淡黄色的炎性细胞浸润（见华君图1A）。模型组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构萎缩、消失，基底膜被破坏，腺上皮变为扁平状，间质和腺上皮内含有大量的棕黄色炎症细胞及炎性分泌物，切片内导管损毁严重（见图1B）；前列通瘀组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构基本完整，腺上皮为单层柱状，间质内和腺腔内含有少量的棕黄色炎症细胞及炎性分泌物（见图1C）；前泌通片高剂量组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构基本完整，腺上皮为柱状上皮，腺腔变大，间质和腺腔内含有少量的棕黄色炎症细胞及炎性分泌物（见图1D）；前泌通片中剂量组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构基本完整，腺上皮为柱状上皮，腺腔变大，间质和腺腔内含有少量的棕黄色炎症细胞及炎性分泌物（见图1E）；前泌通片低剂量组大鼠前列腺组织标本前列腺组织腺腔结构部分萎缩，破坏，腺上皮为扁平上皮，腺腔结构不明显，间质和部分完整的腺腔内含有大量的棕黄色炎性细胞及炎性分泌物（见图1F）。

图1 光镜下各组大鼠前列腺组织图 （IHC×200）A: 空白组； B: 模型组； C: 阳性对照组； D: 前泌通片高剂量组； E: 前泌通片中剂量组； F: 前泌通片低剂量组

二、前泌通片对大鼠前列腺组织IFN-γ/IL-4比值的影响

各实验组大鼠前列腺组织IFN-γ/IL-4比值结果见表1。

由表1可知，与空白组比较，模型组大鼠前列腺组织IFN-γ含量、IL-4含量显著升高（P＜0.01），FN-γ/IL-4比值显著降低（P＜0.01）。提示造模成功。

与模型组比较，前泌通片高剂量组大鼠前列腺组织IFN-γ含量、IL-4含量显著降低（P＜0.01），前泌通片中剂量组、前泌通片低剂量组大鼠前列腺组织IL-4含量显著降低（P＜0.01），前泌通片中剂量组、前泌通片低剂量组大鼠前列腺组织IFN-γ含量降低不明显（P＞0.05），前泌通片高剂量组、前泌通片中剂量组、前泌通片低剂量组大鼠前列腺组织IFN-γ/ IL-4比值显著升高（P＜0.01）。提示前泌通片高剂量组所使用的药物能够下调大鼠前列腺组织IFN-γ和IL-4含量并且能够上调IFN-γ/IL-4比值，而前泌通片中剂量组、前泌通片低剂量组所使用的药物浓度能够下调大鼠前列腺组织IL-4含量，也能上调IFN-γ/IL-4比值。

表1 各实验组大鼠前列腺组织IFN-γ/IL-4比值（）

表1 各实验组大鼠前列腺组织IFN-γ/IL-4比值（）

与空白组对比， *P＜0.01； 与模型组对比， △P＜0.01

组别 大鼠（只） IFN-γ（ng） /IL-4（ng） IFN-γ/IL-4比值空白组 9 669.4711±11.34061 699.5944±20.49162 0.96278±0.29202模型组 6 932.0117±37.39329* 1254.5700±75.85511* 0.74800±0.19701*阳性对照组 6 751.4450±26.27758△ 734.3833±29.20593△ 1.03133±0.53838△前泌通片高剂量组 6 692.5067±51.09733△ 633.7667±55.86556△ 1.10017.±0.23949△前泌通片中剂量组 6 892.7983±31.75990 816.4233±8.36383△ 1.09217±0.27035△前泌通片低剂量组 6 879.8600±36.45963 990.4483±93.43999△ 0.91333±0.57821△

与模型组对比，前列通瘀组大鼠前列腺组织IFN-γ含量、IL-4含量显著降低（P＜0.01），IFN-γ/IL-4比值显著升高（P＜0.01）。提示前列通瘀组所使用的药物浓度能够下调大鼠前列腺组织IFN-γ含量、IL-4含量，也能上调IFN-γ/IL-4比值。

讨 论

CP是男性常见和多发的疾病，发病率高，病程迁延，难愈，严重影响患者生活质量。在CP中，CAP更为多见［9］。关于CAP的病因和发病机制，尚未完全明确，可能与免疫反应、微生物因素、尿液返流、精神心理因素、遗传因素、自主神经功能紊乱、前列腺的慢性充血等有关［10］，其基本的病理发展过程是腺体周围血管充血和炎性细胞渗出，形成腺体周围炎性细胞套，腺上皮中炎性细胞浸润并破坏腺上皮，腺腔内炎性渗出物形成［11］。

自1986年Mosmann等［12］发现CD4 T细胞按其分泌的细胞因子可分为Th1和Th2型以来，人们对Th1/Th2细胞失衡与众多免疫性疾病的关系研究日益深入。Thl细胞主要合成IL-2、IFN-γ等，其中IFN-γ为其特征性细胞，主要参与机体的细胞免疫。Th2细胞主要合成IL-4，IL-5等，其中以IL-4为其特征性细胞，主要参与机体的体液免疫。因此作为Thl的特征性细胞因子IFN-γ和作为Th2的特征性细胞因子IL-4之间的比值可分别反映Thl与Th2的细胞免疫应答水平。Thl型与Th2型免疫应答之间存在着相互牵制的调节机制，能够使得机体维持动态免疫平衡。Thl细胞产生的IFN-γ可抑制Th2类细胞因子的产生，Th2类细胞产生的IL-4和IL-10则可下调Thl细胞的功能，两者相互作用，相互影响，在免疫应答中发挥中心调节作用。在生理条件下，机体Thl/Th2细胞的免疫功能处于动态平衡状态，一旦这种平衡发生偏离，机体就会趋向疾病状态。近年来越来越多的学者研究发现自身免疫和T细胞增殖反应可能参与了CAP的发病过程［13］，CAP可能与自身免疫导致的生殖系统（包括前列腺）损伤有关，而泌尿道感染、急性细菌性前列腺炎和创伤等是其加剧因素。已有的研究表明，免疫反应参与了CP的发病机制［14］。

本病归属于中医“淋症”、“精浊”、“白淫”等疾病范畴中，CP的病因复杂，临床表现多变，病因多属于气滞、瘀血、湿热、气虚或肾虚，实者为气滞、瘀阻、湿热；虚者以肾虚为主。临床医家多责之于湿热瘀浊［15］，在CP发病过程中，我们认为，气滞、血瘀、湿热、肾虚为其主要病机，而气滞血瘀是最主要的病机，气滞血瘀贯穿于疾病的全过程。故主张治疗应以疏肝行气、活血止痛为主，同时配合清热利湿的中药。前泌通片（原名增瀑颗粒）正是在上述治则的指导下，经我科多年临床经验总结，由天台乌药散加减化裁而来，方中台乌药、延胡索行气止痛、活血化瘀为治疗CAP的主药，台乌药辛温，功专行气，治胸腹诸痛和尿频遗尿；延胡索辛苦温，活血行气止痛，善治气血瘀滞诸痛。二药配伍，互相促进，活血行气止痛效彰。木香乃三焦气分之药，能升降诸气，青皮疏肝理气、消积化滞，槟榔行气利水，三药配合，使行气止痛功效增强。泽兰活血祛瘀、利水消肿，配伍延胡索可改善CP的不适症状；CAP多伴有尿频尿急等湿热下注的症状，黄柏作为清热燥湿药，具有清热燥湿、泻火解毒作用；川牛膝活血通经、补肝肾、强筋骨、利水通淋、引火下行，善引诸药下行，以使药达病所，治五淋尿血，茎中痛。以上诸药合用，具有疏肝行气、活血止痛、清热利湿的作用。

本研究结果显示，CAP大鼠模型组IFN-γ含量、IL-4含量显著升高，IFN-γ/IL-4比值降低，Thl/Th2极化异常，提示免疫因素参与了CAP的发病过程。而前泌通片高剂量组大鼠前列腺组织IFN-γ和IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高；前泌通片中低剂量组大鼠前列腺组织IL-4含量降低，IFN-γ/IL-4比值升高。提示前泌通片在治疗CAP的机制中，可能是通过调节IFN-γ和IL-4含量以及调节IFN-γ/IL-4比值来改变调控Thl/Th2比值变化来达到治疗目的的。本实验病理结果显示，前泌通片高、中剂量组与模型组相比较，存活的大鼠前列腺组织病理损伤明显减轻：大鼠前列腺腺腔结构都基本完整，腺上皮为柱状上皮，腺腔变大，间质和腺腔内的棕黄色炎症细胞及炎性分泌物较模型组减少。由此可推断，前泌通片在治疗CAP的过程中也可能通过减轻前列腺炎组织的病理变化来达到治疗目的。

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4 李大伟， 戴宁. 中医药治疗慢性非细菌性前列腺炎的进展. 中医药临床杂志 2010； 22（1）: 85-87

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8 魏武然， 张唯力， 戴君勇. 大鼠慢性非细菌性前列腺炎模型的建立. 中国男科学杂志 2006； 20（1）: 22-24

9 郭应禄， 胡礼泉. 主编. 男科学. 北京: 人民卫生出版社，2004: 3

10 白志明. 慢性前列腺炎研究进展. 海南医学 2006；17（12）: 126-128

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12 Mosmann TR， Cherwinski H， Bond MW， et al. Two types of murine helper T cell clon . I. Definition according to pro les of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol 1986； 136（7）: 2348-2357

13 周晓辉， 韩蕾， 周智恒， 等. 免疫性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的形态学与分子生物学特性. 中华男科学杂志 2005； 11（4）: 290-295

14 Galbiati S， Smid M， Gambini D， et a1. Fetal DNA detection in maternal plasma throughout gestation. Hum Genet 2005； 117（2-3）: 243-248

15 曾庆琪. 慢性前列腺炎病因病机探析. 南京中医药大学学报 2005； 21（3）: 140-142

（2015-05-21收稿）

Therapeutic effect analysis of Qian Mi Tong on chronic nonbacterial prostatitis based on the balance of Th1/Th2 cells*

Li Guangsen1， Chang Degui1，2， Zhang Peihai3， You Yaodong4， Zhong Zhendong5，Yu Xujun2， Chen Diang1， An Zhitao5， Mei Xuefeng1， Cai Jian1**， Bi Mingshuai1**
1. Department of Andrology， Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M， Chengdu 610072， China；
2. Department of Andrology， the Second Teaching Hospital of Chengdu University of T.C.M ； 3. Sichuan Integrative Medicine Hospital； 4. Chengdu University of T.C.M； 5. Department of Pathology， Sichuan Provincial People's Hospital

Cai Jian， E-mail: cireleface1978@163.com； Bi Mingshuai， E-mail: 26469830@qq.com

Objective To explore therapeutic effects of Qian Mi Tong on chronic nonbacterial prostatitis based on the balance of Th1/Th2 cells. Methods A total of 60 SD rats were randomly divided into six groups such as the control group，the model group， positive group and Qian Mi Tong high /medium/low dose group， 10 rats each group. The rat models with chronic nonbacterial prostatitis were established in all groups except the blank group. The rat models in the positive group were intragastrically administrated with Qian Lie Tong Yu capsule. The rat models in qian Mi Tong high /medium/low dose group were intragastrically administrated with qian Mi Tong tablet， and the rats in the control group with normal saline. The forced feeding lasted for 4 weeks. The rats were killed by femoral artery cutting twenty four hours after last time forcd feeding. Pathological changes in prostatic tissue were observed under the light microscope and the expressions of the IFN-γ and IL-4 were measured by immunohistochemistry. Results Compared with that of the model group， tissue in ammationwas signi cantly reduced in Qian Mi Tong high /medium dose group. There is an obvious decrease in expressions of IFN-γ and IL-4 in Qian Mi Tong high dose group （P＜0.01） and also decrease in IL-4 content in Qian Mi Tong medium/low dose group （P＜0.01）. The ratio of IFN- γ/IL-4 was signi cantly increased in Qian Mi Tong high /medium/low dose group （P＜0.01）. Conclusion Qian Mi Tong can relieve the tissue inflammation of rats with chronic nonbacterial prostatitis，downregulate the IFN-γ and IL-4 expression，and increas the ratio of IFN- γ/IL-4.

Qian Mi Tong； prostatitis； Th1cells； Th2 cells

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.08.003

R 697.33

资助: 成都中医药大学附属医院科技基金项目（编号：2011-D-YY-22）

**共同通讯作者: 蔡 剑， E-mail: cireleface1978@163.com； 毕明帅， E-mail: 26469830@qq.com