一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

王重喜，罗学刚，李朋彦，陈小颖，周 浩，张同存，

（1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 武汉科技大学生物医学研究院，武汉 430000）

一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析

王重喜1，罗学刚1，李朋彦1，陈小颖1，周 浩1，张同存1，2

（1. 工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457；2. 武汉科技大学生物医学研究院，武汉 430000）

创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法，用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象，分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后，经离心收集复合物，通过酶标仪检测其荧光值，从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用，荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析，从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析.

蛋白质相互作用；荧光检测；GST-pull down

EYFP作为EGFP蛋白的改进型，可在500，nm的激发光激发下产生528，nm的发射光，因其易于检测，荧光强、发光稳定、没有细胞种类和位置上的限制且载体易于构建，在生物大分子标记和蛋白间相互作用中都有重要应用［6-7］.实验示意图如图1所示.

图1 基于荧光检测的GST-pull down方法示意图Fig. 1 Schema of the GST-pull down based on fluorescence detection

本实验选用已确定能发生相互作用的蛋白对Atsttrin和肿瘤坏死因子受体2（Tumor necrosis factor receptor 2，TNFR2）［8-9］作为实验对象，分别构建GSTAtsttrin原核表达载体和TNFR2-EYFP真核表达载体，并在大肠杆菌及哺乳动物细胞中进行表达.将原核表达的GST-Atsttrin融合蛋白亲和固定到GST树脂上，再向其中加入含有TNFR2-EYFP融合蛋白的细胞裂解液.因Atsttrin和TNFR2间的相互作用而形成树脂-GST-Atsttrin-TNFR2-EYFP复合物，在GST树脂的重力作用下瞬时离心可以得到该复合物.最后利用EYFP的荧光特性，在多功能酶标仪上用500，nm的激发光激发，检测528，nm发射光的荧光值，即可实现对蛋白质间相互作用的分析.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、质粒及菌株

人正常乳腺细胞（HBL100）、非洲绿猴肾成纤维细胞（COS-7）、质粒pGEX-6p-3及pEYFP-N1均为本实验室保存；质粒pMD18T-Atsttrin为实验室前期构建；大肠杆菌（Escherichia coli）JM109和BL21（DE3）由本实验室保存.

1.1.2 主要试剂

Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶，TaKaRa公司；核酸Marker、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，北京康为世纪公司；High-Affinity GST Resin，南京金斯瑞生物科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒和IPTG，北京索莱宝公司；细胞培养基，Gibco公司；细胞胎牛血清，杭州四季青公司；核酸限制性内切酶、蛋白Marker、TuroFect细胞转染试剂，Fermentas公司；实验所用其余试剂均为进口或国产分析纯试剂.引物合成及序列测序由北京英潍捷基公司完成.

1.2 方法

1.2.1 质粒pEYFP-TNFR2构建及鉴定

根据Uniprot提供的TNFR2胞外域蛋白序列（P20333）和NCBI提供的TNFR2基因序列（Gene ID：7133），克隆其胞外域23到257位部分.利用Primer 5.0软件设计引物扩增TNFR2，酶切位点用下划线表示，P1：5'-TAGGAATTC GCCACCATGTTGC CCGCCCAGGTG-3'（EcoRⅠ），P2：5'-GGAGGATCC GAGTCGCCAGTGCTCCCTTCAG-3'（BamHⅠ）.实验中选用人正常乳腺细胞（HBL100）的cDNA作为模板，扩增目的基因TNFR2.将PCR产物和载体pEYFP-N1分别双酶切，切胶回收，经T4，DNA连接酶连接后转化E. coli JM109感受态细胞.经卡那霉素抗性筛选，挑取单克隆进行菌落PCR及双酶切验证，验证正确后经测序鉴定.

1.2.2 质粒pGEX-Atsttrin构建及鉴定

以pMD18T-Atsttrin为模板，通过PCR方法扩增Atsttrin基因.所用引物为P3：5'-TCGGGATCC GAAAA TCTGTATTTTCAGGGCCCGCAGGCTTCCTGCTGT G-3'（BamHⅠ），P4：5'-CCGCTCGAGTTATGGGATT GGACAGCAGC-3'（XhoⅠ）.为方便在今后的引物中切割去除GST标签，在上游引物中引入TEV蛋白酶的切割位点（斜体部分）.将PCR产物和pGEX-6p-3载体分别双酶切，切胶回收，连接转化E. coli JM109感受态细胞.经氨苄青霉素（Amp）抗性筛选后，利用菌落PCR、双酶切及测序鉴定阳性克隆.

1.2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的诱导表达和优化

烧伤在临床上较为多见,一般小面积的Ⅰ度烧伤多半能自愈,但是如果烧伤面积在Ⅱ、Ⅲ度烧伤,易导致创面出现感染,延长患者的住院时间,因此,创面的处理好坏与烧伤后的感染、病程、功能恢复都有着密切的联系,直接影响病情的发展。因此,对于烧伤患者正确的创面处理,合理的外用药物选择都将是烧伤患者治愈的关键环节[1]。对此,本次研究就选取了我院96例(2015年11月-2017年5月)烧伤患者,分别选用了1%磺胺嘧啶银霜和磺胺嘧啶银锌霜两种药物进行治疗,分析以上两种药物对烧伤患者的临床治疗效果的影响,现报道如下。

重组质粒pGEX-Atsttrin转化E. coli BL21（DE3），将转化后的重组表达菌株接种于含Amp（100，µg/mL）的LB液体培养基中，37，℃振荡培养过夜后以2%接种量接种于50，mL含Amp（100，µg/mL）的新鲜LB液体培养基中（250，mL摇瓶），于37，℃培养至A600为0.6～0.8时（约2，h），加入终浓度为1.0，mmol/L的IPTG，30，℃诱导培养4，h.同时以空质粒pGEX-6P-3转化E. coli BL21（DE3）诱导培养作为阴性对照.

诱导时间优化：在30，℃条件下，加入终浓度为1.0，mmol/L的IPTG诱导培养，分别诱导1、2、4、6、8，h后取样用于SDS-PAGE分析.

诱导剂浓度优化：分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，mmol/L的IPTG，30，℃诱导培养，用SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况.

1.2.4 GST-Atsttrin融合蛋白纯化

诱导完毕，4，℃离心收集菌体，用PBS洗涤3次.每100，mg湿菌体加3.3，mL PBS将菌体重悬并超声破碎，4，℃、12，000，r/min离心30，min收集上清液，并用0.45，µm滤膜过滤.用4，℃预冷的PBS平衡GST树脂后，将上清液蛋白上柱纯化.再次用4，℃预冷的PBS洗涤杂蛋白后，取少量与GST-Atsttrin融合蛋白结合的GST树脂用于SDS-PAGE分析，其余4，℃储存用于后续实验.

1.2.5 细胞转染及TNFR2-EYFP融合蛋白的制备

按照脂质体转染试剂说明书操作，将质粒pEYFP-TNFR2转染COS-7细胞.培养24，h后，弃培养基，用PBS洗涤细胞两次，加入1.0，mL细胞裂解液（4，℃预冷），置于冰上裂解30，min后，13，000，r/min离心10，min收集上清液蛋白.

1.2.6 GST-Atstttrin和TNFR2-EYFP相互作用

将50，µL 1.2.4节所得GST树脂加入到500，µL 1.2.5节所得上清液蛋白中，置于旋转摇床，4，℃孵育12，h.800，r/min短暂离心20，s后弃上清液蛋白，用1，mL NETN细胞裂解液（4，℃预冷）重复洗涤3次，用200，µL PBS吹悬树脂.将所得树脂加入到96孔荧光检测板中，在多功能酶标仪（Bioteck）上用500，nm的激发光激发，检测528，nm发射光的荧光值.

2 结 果

2.1 重组质粒pEYFP-TNFR2和pGEX-Atsttrin的构建及鉴定

以HBL100细胞的cDNA为模板，用引物P1和P2扩增TNFR2基因，并定向克隆到载体EcoRⅠ和BamHⅠ之间.PCR后可扩增出与预期大小相符的目的条带，且重组质粒经双酶切可检测到目的条带（图2（a））.另一方面，以pMD18T-Atsttrin为模板，用引物P3和P4扩增Atsttrin基因并亚克隆到pGEX-6P-3质粒中.重组质粒经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后可检测到与预期大小相符的目的条带（图2（b））.进一步通过测序证实，重组质粒pEYFP-TNFR2和pGEXAtsttrin均构建成功.

图2 质粒构建Fig. 2 The construction of recombinant vectors

2.2 GST-Atsttrin融合蛋白的诱导表达

质粒pGEX-6p-3和pGEX-Atsttrin分别转化E. coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，GST-Atsttrin融合蛋白诱导表达与可溶性分析如图3所示.重组菌株经IPTG诱导后在相对分子质量4.3×104处可见GST-Atsttrin融合蛋白条带（GST蛋白相对分子质量约2.6×104，Atsttrin蛋白相对分子质量约1.7× 104）.进一步对菌体超声破碎后所获得的上清和沉淀进行电泳分析，结果显示目的蛋白可溶率达90%.

图3 GST-Atsttrin融合蛋白诱导表达与可溶性分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the expression and solubility of GST-Atsttrin fusion protein

为进一步优化诱导表达条件，首先将重组菌株E. coli BL21（DE3）/pGEX-Atsttrin以1.0，mmol/L的IPTG 30，℃诱导培养8，h，每2，h取样分析.SDS-PAGE电泳结果显示重组蛋白的可溶性表达量随诱导时间延长而增加，诱导6，h时融合蛋白有最大的表达量（图4（a））.进而分别在30，℃以终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0，mmol/L的IPTG条件下诱导培养6，h，结果表明0.6，mmol/L的IPTG对菌体诱导效果最好（图4（b））.对优化后融合蛋白的可溶性进行分析，结果显示目的蛋白依然具有很好的可溶性（图5）.因而确定GST-Atsttrin融合蛋白诱导表达的最优条件为30，℃，以0.6，mmol/L的IPTG诱导6，h. Quantity one软件分析显示可溶性融合蛋白的量可占菌体总蛋白的30%以上.

图4 诱导表达时间及IPTG浓度的优化Fig. 4Optimization of the induction time and concentration of IPTG

图5 优化后蛋白可溶性分析Fig. 5Analysis of the solubility of GST-Atsttrin fusion protein

2.3 GST-Atsttrin融合蛋白的纯化

将诱导菌体超声破碎后，离心取上清于GST亲和层析柱纯化融合蛋白.SDS-PAGE分析结果显示：通过一次亲和层析可除去绝大多数的杂蛋白，但在相对分子质量为2.8×104的附近依然存在一条杂蛋白带，其位置与空质粒pGEX-6P-3诱导表达的GST产物相同（图6，图3（a））.由此表明重组菌株E. coli BL21（DE3）/pGEX-Atsttrin在表达融合蛋白的同时，也会产生一定的GST单独表达产物.这很可能是由于人源基因Atsttrin密码子与E. coli偏爱性间所存在的差异造成翻译出现中断或外源基因mRNA不稳定发生断裂而造成的.

图6 GST-Atsttrin融合蛋白的纯化Fig. 6 Purification of the GST-Atsttrin fusion protein

2.4 细胞转染及TNFR2-EYFP融合蛋白的荧光检测

将质粒pEYFP-TNFR2转染COS-7细胞，培养24，h后，通过荧光显微镜分析TNFR2-EYFP目的蛋白的表达情况，结果如图7所示.

图7 细胞转染pEYFP-TNFR2质粒后荧光图片Fig. 7 Micrographs of cells transfected with pEYFPTNFR2 vector

转染细胞可观测到明显的荧光，表明融合蛋白在细胞内可获得很好地表达.进一步收集转染后的细胞，裂解收取上清获得TNFR2-EYFP样品，利用多功能酶标仪对荧光信号进行定量分析，结果如图8所示.结果显示细胞裂解液试剂对荧光值的测定没有影响；同时，荧光值与融合蛋白TNFR2-EYFP样品间具有良好的剂量依赖关系，表明荧光值的强弱可以很好地反映出EYFP融合蛋白的含量高低.

图8 TNFR2-EYFP融合蛋白的荧光值与其剂量间的关系Fig. 8Relationship between the fluorescence of TNFR2-EYFP fusion protein and its amount

2.5 Atsttrin和TNFR2相互作用分析

为验证荧光测定方法是否可很好地用于蛋白质间相互作用的GST-pull down分析，首先对GST-pull down系统所涉及到的COS-7细胞及E. coli内源性杂蛋白、GST标签蛋白及树脂对EYFP荧光测定是否会产生干扰进行了分析.与对照组相比上述“杂质”均不会对EYFP荧光值的测定产生显著性的影响（图9（a））.在此基础上，分别将Atsttrin-GST-树脂复合物、GST-树脂复合物与转染pEYFP-TNFR2的细胞裂解液共同孵育，短暂离心并用PBS清洗GST树脂后，于多功能酶标仪中测定EYFP的荧光值.与GST-树脂复合物相比，Atsttrin-GST-树脂复合物在与pEYFP-TNFR2细胞裂解液孵育后，可检测到明显的荧光信号（图9（b）），表明Atsttrin-GST-树脂复合物可将TNFR2-EYFP从细胞裂解液中捕获富集出来，且荧光检测法能够很好地检测这一过程.改进后的方法可很好地用于蛋白质间相互作用的分析.

图9 Atsttrin和TNFR2相互作用分析Fig. 9 Interaction analysis of Atsttrin and TNFR2

3 讨 论

相比酵母双杂交、Co-IP、FRET等方法，GST-pull down简便易行、实验重现性好，因此在蛋白质相互作用分析方面得到了广泛的应用.本研究在传统GST-pull down方法基础上，对其进行了改进.通过将靶蛋白与EYFP融合表达，以EYFP荧光值的检测代替传统方法中的SDS-PAGE及Western blot分析，从而大大简化了GST-pull down分析步骤、降低了操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效的分析.本研究结果显示EYFP的荧光值与EYFP融合蛋白的含量间具有良好的剂量依赖关系，且整个实验体系中可能存在的真核细胞及E. coli的内源性物质、GST蛋白、亲和树脂、细胞裂解液等“杂质”均不会对EYFP荧光测定产生显著性影响，因此本方法可很好地通过检测EYFP荧光值的大小实现对蛋白质间相互作用的分析.

正确空间结构的形成对于蛋白质相互作用的体外分析十分重要［4］.GST是E. coli天然高效、可溶性表达的蛋白质，在作为融合表达标签时可促进目的蛋白质二硫键的形成，从而使表达产物折叠形成正确的空间结构［5，10］.此外，GST还有利于增强融合蛋白的翻译效率及稳定性，从而大大提高表达水平［11］.在本实验中，经过条件优化，在30，℃、IPTG浓度为0.6，mmol/L时诱导培养6，h，可确保GST-Atsttrin融合蛋白的表达量达到最大（250，mg/mL），同时可溶性蛋白比率可高达90%以上，确保了相互作用分析的正确性.

在本实验中选用的研究对象Atsttrin是新近报道的TNFR2特异性拮抗蛋白［8-9］.TNFα 作为促炎因子，在类风湿性关节炎（rheumatoid arthrits，RA）、银屑病性关节炎（psoriasis arthritsi，PA）、强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）等免疫系统疾病过程中起着重要作用［12-13］.相比于TNFR1，TNFR2相对有限的细胞分布，使得TNFR2成为更为特异、安全的治疗靶点［14-15］.Atsttrin可与TNFα 竞争对TNFR2的结合，从而有效发挥对类风湿性关节炎的高效抑制作用［8-9］.不仅如此，药物动力学分析表明Atsttrin在体内具有较为理想的消除半衰期和生物利用度，表明Atsttrin及其衍生物将是有潜力的抗关节炎新药［8-9］.本文改进后的GST-pull down方法可为Atsttrin蛋白质序列的进一步优化以及新型抗关节炎新药的筛选提供一种新的有力手段.此外，在质粒构建时，还在GST与Atsttrin之间添加了TEV蛋白酶的切割位点，后续亦可通过TEV酶切释放Atsttrin，用于该蛋白质的制备生产.

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责任编辑：周建军

An Improved Method of GST-pull Down Based on Fluorescence Detection and its Application to the Analysis of the Interaction between Atsttrin and TNFR2

WANG Chongxi1，LUO Xuegang1，LI Pengyan1，CHEN Xiaoying1，ZHOU Hao1，ZHANG Tongcun1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Institute of Biology and Medicine，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430000，China）

An improved method of GST-pull down based on fluorescence detection was developed and could be applied to analyzing protein interaction. Based on the confirmed interaction between TNFR2 and Atsttrin，recombinant expression vectors pGEX-Atsttrin and pEYFP-TNFR2 were constructed. GST-Atsttrin fusion proteins were purified by affinity chromatography，and then incubated with TNFR2-EYFP fusion proteins. After centrifugation，the complex was collected，and the interaction between Atsttrin and TNFR2-EYFP was analyzed through measuring the fluorescence intensity with multifunctional microplate reader. The interaction between Atsttrin and TNFR2 was verified by the detection of the fluorescence after the GST-pull down. Compared with the traditional method，the new method was more convenient and could be used to analyze the target protein without specific antibodies.

protein interaction；fluorescence detection；GST-pull down

Q71 文献标志码：A 文章编号：1672-6510（2015）01-0034-07

10.13364/j.issn.1672-6510.20140062

蛋白质间的相互作用在生物细胞的生命活动中发挥着重要作用，研究蛋白质间的相互作用，对于蛋白质功能的分析、疾病机理的阐明和新药的研发具有十分重要的意义［1-2］.目前常用的研究蛋白质间相互作用的方法主要有酵母双杂交、GST-pull down、免疫共沉淀（Co-IP）和荧光能量共振转移（FRET）等［3］.其中，GST-pull down技术是利用谷胱甘肽巯基转移酶（GST）与谷胱甘肽间的特异性结合，研究蛋白质体外直接相互作用的重要手段［2，4］.其基本原理［3，5］是将目的蛋白与GST标签融合表达，将得到的融合蛋白亲和固定到谷胱甘肽树脂上当作“诱饵蛋白”，加入另一种蛋白溶液后，由于蛋白质间的相互作用，可从中捕获出能与目的蛋白相互作用的“靶蛋白”，而形成GST-诱饵蛋白-靶蛋白的复合物.收集复合物后通过SDS-PAGE或Western blot检测靶蛋白的存在，从而分析证实目的蛋白和靶蛋白间的相互作用.然而，SDS-PAGE分析对靶蛋白的测定特异性较低，而Western blot检测则步骤繁琐、操作难度较大、成本较高，而且无法适用于缺乏特异性抗体的靶蛋白（如新发现的蛋白质或免疫原性较弱的蛋白质）的分析，因此该方法需进一步改良.

2014-04-19；

2014-06-25

国家高技术研究发展计划（863计划）资助项目（2012AA021505）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”资助项目（IRT1166）

王重喜（1989—），男，硕士研究生；通信作者：罗学刚，副教授，luoxuegang@hotmail.com.