猪仔笠黄酮类化合物的提取工艺及其稳定性

谢勇平 ,李清禄 ,应顺秋

(福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

猪仔笠黄酮类化合物的提取工艺及其稳定性

谢勇平 ,李清禄 ,应顺秋

(福建农林大学生命科学学院 ,福建福州350002)

在单因素试验的基础上 ,通过正交试验 ,确认猪仔笠黄酮类化合物的最佳提取工艺为:乙醇含量45%、料液比1∶30、提取温度70℃、提取时间4 h.探讨光照、加热、pH和存放时间对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响.结果表明:猪仔笠黄酮类化合物在暗室和室内自然光照下较稳定 ,室外强光照下其含量明显下降；加热对黄酮类化合物稳定性的影响不明显；pH对黄酮类化合物稳定性的影响较大 ,在pH为5－6时的稳定性最好；猪仔笠黄酮类化合物可存放一定时间 ,暗室内存放60 d ,黄酮类化合物保存率为98.32%.

猪仔笠；黄酮类化合物；提取工艺；稳定性

黄酮类化合物是广泛存在于水果、蔬菜和中草药中的一种重要的天然有机化合物 ,是一种植物多酚次生代谢产物 ,在植物体内少数以游离形式存在 ,大部分与糖结合成苷.大量研究表明 ,黄酮类化合物不仅具有抑菌、抗氧化、保肝、抗炎和免疫调节作用 ,而且在治疗心血管疾病和抗肿瘤等方面具有一定的疗效[1－6].

植物黄酮类化合物的提取方法主要有醇类提取法、热水提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法和微波加热提取法等.超声波辅助提取法、超临界流体萃取法和微波加热提取法具有提取率高和产品活性高的优点 ,但无法大规模提取 ,同时生产成本高 ,难以工业化生产；醇类提取法和热水提取法虽耗时长 ,但提取率和产品纯度均相对较高 ,同时操作简单 ,易实现大规模提取.因此 ,工业提取黄酮类化合物多采用这两种方法.

不同植物来源的黄酮提取物 ,所含成分的种类和含量各不相同 ,因此在各种条件下的稳定性也不同.探讨黄酮提取物在不同条件下的稳定性 ,对黄酮产品的加工和存放、质量控制等方面具有重要的指导意义.如探讨光照对黄酮类化合物稳定性的影响 ,可以选择储存黄酮产品的材质(马口铁罐、透明玻璃瓶或是棕色玻璃瓶)；探讨加热对稳定性的影响 ,可以判断加工过程是否可以有适当的热处理.

猪仔笠(Eriosema chinense Vog.)为豆科毛瓣花属植物 ,约100种 ,分布于热带和亚热带地区.据«中药大词典»记载:猪仔笠块根入药 ,具有清热解毒、生热烦渴、化痰润肺、止咳之功效 ,是治疗伤风咳嗽、上呼吸道感染、发热烦渴、痢疾、跌打损伤等疾病的珍稀名贵中草药.猪仔笠虽然已在民间应用较广 ,但对其黄酮成分的提取、稳定性以及生物活性的研究尚未见报道.本试验采用传统的醇类提取法 ,以黄酮类化合物提取量为考察指标 ,通过单因素和正交试验对猪仔笠黄酮类化合物的提取工艺进行优选 ,并探讨光照、加热、pH和存放时间对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响 ,旨在为猪仔笠的有效开发利用提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 猪仔笠购自福建龙岩 ,由福建省中医药研究院王振登研究员鉴定；芦丁对照品购自中国药品生物制品检定所；石油醚为AR ,沸程60－90℃；无水乙醇、乙酸丁酯、正丁醇、AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH和浓硫酸均为AR.

1.1.2 仪器 主要仪器有电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)、BS210S型微量分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)、粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)、循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、HH-2数显恒温水浴锅(上海国华仪器设备有限公司)、恒温循环器(北京博医康实验仪器有限公司)、冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、Cary50紫外可见分光光度计(美国VARIAN公司)和ZF-1型三用紫外分析仪(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司).

1.2 猪仔笠黄酮类化合物的提取工艺

1.2.1 黄酮类化合物的提取 猪仔笠块根用蒸馏水洗涤 ,置于60℃的干燥箱中恒温烘干24 h ,取出后粉碎.称取5.0 g块根粉末用一定体积不同含量的乙醇恒温加热回流一定时间 ,连续提取3次.收集合并提取液 ,经减压过滤浓缩至干 ,得棕色膏状提取物.加入20 mL蒸馏水混悬 ,用20 mL石油醚(60－90℃)依次萃取3次除去脂类物质 ,取下层清夜收集合并 ,再经减压蒸馏 ,得粗黄酮提取物 ,加入70%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中 ,备用.

1.2.2 黄酮类化合物含量的测定 采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH法[7]测定 ,参照文献建立的标准曲线测定猪仔笠黄酮类化合物的含量.

1.2.3 单因素试验 在提取条件的选择中 ,以猪仔笠黄酮类化合物的提取量为衡量指标 ,提取溶剂为乙醇 ,选取提取温度、乙醇含量、提取时间和料液比4个主要因素 ,分析它们对黄酮类化合物提取量的影响.

1.2.4 正交试验 以猪仔笠黄酮类化合物的提取量为分析指标 ,采用乙醇作为提取溶剂 ,以提取温度、乙醇含量、提取时间和料液比作为考察因素 ,在各因素最佳值的附近分别选取3个水平 ,根据L9(34)正交试验表进行设计 ,作4因素3水平正交试验 ,以确定黄酮类化合物的最佳提取工艺.采用直观分析方法 ,依据极差大小和方差分析确定提取条件的主次顺序.

1.3 猪仔笠黄酮类化合物的稳定性试验

1.3.1 光照的影响 将制备的黄酮类化合物提取液高压蒸汽灭菌20 min ,测定黄酮类化合物含量后蜡封 ,分别置于暗室、室内自然光照和室外强光照(每天光照6 h)下 ,每隔1 d测定黄酮类化合物含量 ,每个样品重复3次 ,连测5 d.

1.3.2 加热的影响 将黄酮类化合物提取液分别在60、70、80、90和100℃加热30 min ,测定黄酮类化合物含量 ,每个样品重复3次.

1.3.3 pH的影响 用4%NaOH和10%H2SO4调节黄酮类化合物提取液的pH ,pH分别配制为2、3、4、5、6、7、8、9和10 ,静置30 min后测定黄酮类化合物含量 ,每个样品重复3次.

1.3.4 存放时间的影响 将黄酮类化合物提取液高压蒸汽灭菌20 min ,测定黄酮类化合物含量后蜡封 ,置于暗室 ,每隔10 d测定黄酮类化合物含量 ,共测定60 d ,每个样品重复3次.

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以光密度(D)对芦丁含量(C)作回归处理得标准曲线(图1) ,回归方程:D＝18.4570C－0.0004(R2＝0.9997).

2.2 单因素对猪仔笠黄酮类化合物提取工艺的影响

2.2.1 乙醇含量的影响 分别以35%、45%、55%、65%和75%乙醇为提取溶剂 ,在料液比为1∶30 ,提取温度为80℃的条件下提取3 h ,乙醇含量对猪仔笠黄酮类化合物提取量的影响见图2.

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

图2 乙醇含量对黄酮类化合物提取效果的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield

图2表明 ,随着乙醇含量的增加 ,黄酮类化合物的提取量先升高后降低 ,提取量最高点出现在乙醇含量为55%的时候 ,当乙醇含量继续增加时 ,黄酮类化合物提取量开始下降.一方面可能是由于含量为55%的乙醇的极性与猪仔笠黄酮类化合物的极性最相似 ,黄酮类化合物的溶解度最大；另一方面也可能是随着乙醇含量的增加 ,醇溶性杂质溶出量增多 ,与黄酮类化合物争夺溶剂 ,导致黄酮类化合物提取量降低.因此 ,提取溶剂宜选取含量为55%的乙醇.

2.2.2 提取时间的影响 以55%乙醇为提取溶剂 ,在料液比为1∶30 ,提取温度为80℃的条件下分别提取1、2、3、4和5 h ,提取时间对猪仔笠黄酮类化合物提取量的影响见图3.

图3表明 ,提取时间从1 h增加至3 h ,黄酮类化合物提取量迅速增加 ,但随着提取时间继续增加 ,黄酮类化合物提取量的增加趋势变得缓慢.综合考虑黄酮类化合物提取量和节约能源的需要 ,确定最佳的提取时间为3 h.

2.2.3 料液比的影响 以55%乙醇为提取溶剂 ,在料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 ,提取温度为80℃的条件下提取3 h ,料液比对猪仔笠黄酮类化合物提取量的影响见图4.

图3 提取时间对黄酮类化合物提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield

图4 料液比对黄酮类化合物提取效果的影响Fig.4 Effect of material-liquid ratio on extraction yield

图4表明 ,黄酮类化合物提取量随着溶剂的增多逐渐增加 ,这是由于溶剂用量的增加 ,有利于黄酮类化合物由原料向浸提液扩散.刚开始随着溶剂用量的增加 ,黄酮类化合物提取量迅速增加 ,在料液比达到1∶30后 ,继续增加溶剂用量 ,黄酮类化合物提取量的增加趋势变得缓慢.基于提取量和节省溶剂的双重考虑 ,选择最佳的料液比为1∶30.

2.2.4 提取温度的影响 以55%乙醇为提取溶剂 ,在料液比为1∶30 ,提取温度分别为50、60、70、80和90℃的条件下提取3 h ,提取温度对猪仔笠黄酮类化合物提取量的影响见图5.

图5表明 ,提取温度从50℃升高至80℃ ,黄酮类化合物提取量逐渐增加.一方面是由于提取温度越高 ,黄酮类化合物在提取溶剂中的溶解度越大；另一方面 ,温度升高 ,分子热运动加剧 ,扩散、渗透速度加快 ,黄酮类化合物更容易从植物细胞转移到提取溶剂中.当温度高于80℃时 ,黄酮类化合物提取量降低 ,可能是由于部分黄酮类化合物在高温下不稳定 ,被氧化破坏 ,同时高温下杂质的溶出量增多 ,对后续的萃取操作造成一定的影响.综上所述 ,选择最佳的提取温度为80℃.

2.3 正交试验结果

依据单因素试验结果 ,确定正交试验的因素和水平如表1所示.

图5 提取温度对黄酮类化合物提取效果的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction yield

表1 正交试验的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

根据选择的因素和水平作L9(34)正交试验 ,结果见表2.由表2的R可以看出 ,正交试验所考察的影响猪仔笠黄酮类化合物提取量的4个因素中 ,影响主次关系为:提取时间(D)>料液比(B)>乙醇含量(A) >提取温度(C).方差分析结果(表3)表明 ,提取时间和料液比对黄酮类化合物提取量有显著影响.

表2 正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal experiment

表3 正交试验结果方差分析1)Table 3 Variance analysis of the orthogonal test

综合考虑确认猪仔笠黄酮类化合物的最佳提取因素水平组合为A1B2C1D3,即乙醇含量为45% ,料液比为1∶30 ,在70℃下提取4 h.

2.4 4个因素对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响

2.4.1 光照的影响 从光照对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响(图6)可以看出 ,无论是暗室、室内自然光照 ,还是室外强光照下 ,随着时间的推移 ,黄酮类化合物均会逐渐降解.其中 ,于暗室降解最慢 ,5 d后的保存率达到99.82%；其次在室内自然光照下 ,5 d后的保存率为98.25%；室外强光照对黄酮类化合物有较强的降解作用 ,5 d后的保存率仅为91.74%.可见 ,猪仔笠黄酮类化合物在生产、储存和运输的过程中应避免强光照射.

图6 光照对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响Fig.6 Effect of illumination on stability of the flavonoids from E.chinense

2.4.2 加热的影响 从加热对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响(图7)可以看出 ,加热会导致黄酮类化合物降解 ,温度越高 ,降解程度越大.总体来看 ,在100℃下加热半小时后的保存率最低 ,为97.42% ,表明猪仔笠黄酮类化合物对温度不太敏感 ,比较稳定.

2.4.3 pH的影响 从pH对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响(图8)可以看出 ,pH对黄酮类化合物稳定性的影响较大.pH为5－6时最稳定 ,尤其在pH为6时 ,保存率高达99.62%；pH太高或太低对黄酮类化合物的稳定性都不利 ,尤其在pH为10时 ,保存率仅为67.84%.

图7 加热对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响Fig.7 Effect of heating on the stability of flavonoids from E.chinense

图8 pH对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响Fig.8 Effect of pH on the stability of flavonoids from E.chinense

2.4.4 存放时间的影响 从暗室存放时间对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响(图9)可以看出 ,随着存放时间的延长 ,黄酮类化合物缓慢降解 ,60 d后的保存率为98.32%.表明猪仔笠黄酮类化合物比较稳定 ,可以在暗室存放一定时间.

3 讨论

(1)天然产物有效成分提取常用的优化方法有单因素分析法和正交设计分析法.本试验对猪仔笠黄酮类化合物的提取条件作4因素3水平的正交试验 ,可在一定程度上克服了单因素分析法和正交设计分析法各自的局限性 ,最终确定最佳的提取工艺为:采用回流提取法 ,以45%乙醇为提取溶剂 ,在料液比为1∶30 ,提取温度为70℃的条件下提取4 h.影响猪仔笠黄酮类化合物提取量的4个因素中 ,影响主次关系为:提取时间>料液比>乙醇含量>提取温度.方差分析结果表明 ,提取时间和料液比对猪仔笠黄酮类化合物提取量有显著影响.

(2)黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的黄色色素 ,不同植物来源的黄酮提取物受光照影响较大[8－10].本试验结果表明 ,在室外强光照下 ,猪仔笠黄酮类化合物发生较强的降解作用 ,因此 ,猪仔笠黄酮类化合物在生产、储存和运输的过程中应避免强光直照.不同植物来源的黄酮提取物 ,所含成分的种类和含量各不相同 ,对温度的敏感性也不同.侧柏叶黄酮在温度大于50℃时就明显降解[11]；野菊花黄酮在100℃下加热30 min ,黄酮含量稳定[9].本试验结果表明 ,猪仔笠黄酮类化合物对温度不太敏感 ,比较稳定 ,在生产中可以进行热处理 ,但处理时间不宜过长.pH是黄酮稳定性的一个重要因素 ,不同植物来源的黄酮提取物一般在酸性条件下稳定 ,中性和碱性条件下不稳定 ,均有各自适合的pH.如桑白皮黄酮在pH为2.2－6下较稳定[8],野菊花黄酮在pH为3.9－5.9下较稳定[9].本试验结果表明 ,猪仔笠黄酮类化合物的适宜pH为5－6 ,此时黄酮类化合物含量最高 ,最稳定.猪仔笠黄酮类化合物在暗室中降解缓慢 ,因此可以在暗室中储存一定时间.

图9 暗室存放时间对猪仔笠黄酮类化合物稳定性的影响Fig.9 Effect of stored time on the stability of flavonoids from E.chinense

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(责任编辑:施晓棠)

The extraction and stability of flavonoids from Eriosema chinense

XIE Yong-ping ,LI Qing-lu ,YING Shun-qiu
(College of Life Science ,Fujian Agriculture and Forestry University ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

Experiments were carried out to study the optimal extraction condition of flavonoids from Eriosema chinense Vog.using four-factor-five-level orthogonal design.The study investigated key factors including ethanol content(35%－75%) ,extraction dura-tion(1－5 h) ,material-liquid ratio(1∶10－1∶50) ,extraction temperature(50－90℃).Results implied that the optimal extrac-tion parameter was to set material-liquid ratio at 1∶30 with 45%ethanol and be extracted at 70℃for 4 h.Stability of flavonoids was discussed by examining parameters such as light ,heat ,pH and stored time.Results showed that flavonoids from E.chinense were more stable in dark than illuminated conditions.Flavonoids content dropped to 91.74%in bright outdoor in 5 days ,compared with 99.82%in darkroom.pH greatly affected stability of flavonoid with pH 5－6 being the optimal storage acidity.Heat and store time ex-hibited less effect on the stability of flavonoids than the other two parameters.Flavonoids content remained at 98.32%after 60 days in darkroom.

Eriosema chinense；flavonoids；extraction technology；stability

TQ28

A

1671-5470(2015)06-0612-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.009

2015－04－12

2015－06－02

福建省自然科学基金资助项目(2013J01360)；福建省教育厅B类科技项目(JB12052).

谢勇平(1978－) ,男 ,讲师 ,硕士.研究方向:天然产物活性成分提取.Email:xypnm＠163.com.通讯作者李清禄(1957－) ,男 ,教授.研究方向:天然产物活性成分提取.Email:lql3388＠126.com.