香蕉细菌性枯萎病菌超分支滚环扩增快速检测技术

王念武，陈劲松，沈建国，黄 振，翁瑞泉

(1.福清出入境检验检疫局，福建 福清350300;2.泉州出入境检验检疫局，福建 泉州362000;3.福建出入境检验检疫局，福建 福州350002;4.福州机场出入境检验检疫局，福建 福州350002)

香蕉细菌性枯萎病菌(Ralstonia solanacearum race 2，Rs2)是危害香蕉最严重的病原细菌，R. solanacearum 种以下有不同的race 型，根据寄主的不同而分为5 个races［1］，香蕉细菌性枯萎病菌则属于其中的race 2。香蕉细菌性枯萎病菌主要侵害三倍体香蕉及赫蕉，可致使植株发生严重的枯萎，最终导致整株死亡［2，3］。香蕉细菌性枯萎病菌是我国禁止进境的检疫性有害生物，在我国未见分布。我国虽然对进境香蕉和香蕉种苗进行检疫，但对进境芭蕉属(Musa)和蝎尾蕉属(Heliconia)的景观类植物未进行该细菌的检测，而这些植物也可作为香蕉细菌性枯萎病菌寄主［4］，对携带并传入该病菌存在一定的风险。

Nilsson et al［5］于1994年提出锁式探针检测技术。近年来，该技术以灵敏、特异、稳定等特点，广泛用于微生物鉴定、细胞原位检测、医学病原检测等领域。该技术可以在恒温下等温扩增［6］，1 h 内达到109个拷贝数［7］。本研究根据香蕉细菌性枯萎病菌独有的插入序列ISRso19，设计特异性锁式探针，采用超分支滚环扩增(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)技术，对香蕉细菌性枯萎病菌的检测方法进行研究，以期为口岸把关和疫情监测提供新的检测方法。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

香蕉细菌性枯萎病菌由中国检验检疫科学院赵文军研究员提供;番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis)、杨桃细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv. Averrhoii)、番茄青枯病菌(R.solanacearum race 1)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.Oryzicola)、番茄细菌性叶斑病菌(P. syringae pv. Tomato)、柑橘溃疡病菌(X. citri)和西瓜果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.Citrulli)由福建农林大学细菌实验室提供。

1.2 试剂与仪器

Taq DNA 连接酶(NEB 公司)，核酸外切酶Ⅰ(NEB 公司)，核酸外切酶Ⅲ(NEB 公司)，Bst DNA 聚合酶(NEB 公司)，2 ×PCR Master Mix(Tangen 公司)，Sterilized ddH2O(NEB 公司)，dNTPs(Promega 公司)，100bp DNA Ladder(Tangen 公司)，细菌基因组DNA 提取试剂盒(TIANGEN Bacterial DNA Kit)。PCR 仪(ABI 公司)，凝胶成像系统，核酸蛋白仪(瑞典AMERSHAM，型号ULTROSPEC1100)，电泳仪(瑞典AMERSHAM)，离心机(Eppendorf 公司)。

1.3 锁式探针的设计

以Lee et al［8］获得的香蕉细菌性枯萎病菌插入序列IS Rso19 部分碱基序列(GenBank:AF450275)作为靶标DNA 模板，按照王念武等［9］的方法设计Rs2 的锁式探针。设计合成的锁式探针及引物见表1。

表1 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 的锁式探针和引物Table 1 Primers and padlock probe of HRCA for Rs2

1.4 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增

1.4.1 锁式探针的环化连接 以提取的香蕉细菌性枯萎病菌和其他参试菌株的DNA 为模板，分别与锁式探针PLPrs2 进行环化连接。10 μL 反应体系为:DNA 模板2 μL，40 U·μL-1Taq DNA 连接酶0.15 μL，400 pmol·L-1探针0.2 μL，10 ×Taq DNA 连接酶缓冲液1 μL，无菌去离子水补至10 μL。反应条件为:94℃4 min;94 ℃35 s，65 ℃5 min，15 个循环;95 ℃10 min 灭活剩余连接酶。反应完成后，立即将产物冰浴5 min 用于之后试验，或置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.2 未环化锁式探针的消化 预先制配10 μL 混合液。混合液构成为:5 U·μL-1核酸外切酶Ⅲ1 μL，10 ×核酸外切酶Ⅲ缓冲液2 μL，10 U·μL-1核酸外切酶Ⅰ1 μL，10 ×核酸外切酶Ⅰ缓冲液2 μL，无菌去离子水4 μL。向环化连接后的产物中加入该10 μL 预混液后，37 ℃水浴2.5 h 消化未环化的锁式探针，再于90 ℃水浴15 min，灭活核酸外切酶。

1.4.3 HRCA 扩增 用扩增引物进行超分支滚环扩增。以锁式探针连接环化、消化后的产物作为模板，反应体系为25 μL(环化连接消化后产物2 μL，10 μmol·L-1padR 0.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μmol·L-1padF 0.5 μL，8 U·μL-1Bst DNA 聚合酶0.5 μL，10 ×Bst DNA 聚合酶缓冲液2.5 μL，灭菌去离子水补至25 μL)。63 ℃恒温条件下反应1.5 h。反应结束后每个样取8 μL 进行电泳，琼脂糖凝胶浓度为2.0%，最后经染色、凝胶成像分析反应结果。

1.5 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增的特异性

以供试的香蕉细菌性枯萎病菌等9 种细菌的DNA 为模板，按照上述方法，分别与锁式探针PLPrs2 进行超分支滚环扩增，测试香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增的特异性。

1.6 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增的灵敏度

香蕉细菌性枯萎病菌DNA 浓度经测定后，进行系列稀释。之后各取2 μL 作为DNA 模板，按照上述方法，分别与锁式探针PLPrs2 进行超分支滚环扩增，测试香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增的最低DNA 检测浓度。

2 结果与分析

2.1 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增检测技术的建立

在香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增试验中，分别优化了线性探针的终浓度和扩增的反应温度。结果表明，HRCA 扩增的最适反应温度为63 ℃(图1)，线性探针最佳终浓度为5 pmol·L-1(图2);在消化反应中，用6 U 核酸外切酶Ⅲ和10 U 核酸外切酶Ⅰ共同消化连接产物2.5 h，可以消除线性探针的干扰影响。优化后的香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增产物经电泳、凝胶成像分析，呈典型的阶梯状条带(图3)。

图1 不同温度下的香蕉细菌性枯萎病菌HCRA 扩增 Fig.1 HRCA under different temperature for Rs2

图2 不同终浓度探针的香蕉细菌性枯萎病菌HCRA 扩增Fig.2 HRCA under different final concentration of padlock probe for Rs2

2.2 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增的特异性

在供试的9 种细菌中，仅香蕉细菌性枯萎病菌出现阶梯状分布条带，检测结果为阳性;其余8 种细菌均未出现阶梯状分布条带，结果为阴性(图4A)。该结果表明，HRCA 扩增检测香蕉细菌性枯萎病菌具有特异性。另外，采用Lee et al［8］提供的引物对供试的9 种细菌进行PCR 扩增，仅香蕉细菌性枯萎病菌的PCR 扩增结果呈阳性，其他则为阴性(图4B)。比较HRCA 扩增和PCR 扩增结果，两种方法扩增结果一致，都具有特异性。因此，建立的香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 技术对香蕉细菌性枯萎病菌有特异性，可以用于该菌快速检测。

图3 香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 扩增电泳图Fig.3 The electrophorogram of HRCA for Rs2

2.3 HRCA 扩增检测香蕉细菌性枯萎病菌的灵敏度

当香蕉细菌性枯萎病菌DNA 浓度≥500 fg·μL-1时，结果为阳性;当DNA 浓度＜500 fg·μL-1时，结果呈阴性(图5)，最低DNA 检测浓度为500 fg·μL-1。采用Lee et al［8］的PCR 方法，检测香蕉细菌性枯萎病菌的灵敏度，结果表明，最低DNA 浓度为5 pg·μL-1(图5)。比较HRCA 方法和常规PCR 方法可以发现，HRCA 方法具有更高的灵敏度，高出常规PCR 扩增方法一个数量级。

图4 HRCA 法检测香蕉细菌性枯萎病菌的特异性Fig.4 Detected specificity by HRCA for Rs2

图5 HRCA 法检测香蕉细菌性枯萎病菌的灵敏度Fig.5 Detected sensitivity by HRCA for Rs2

3 讨论

细菌快速检测方法各有优势和不足。血清学ELISA 方法灵敏度低，适用于细菌的初筛;常规PCR 方法和实时荧光PCR 方法，有较高的灵敏度，但容易受模板DNA 的污染，而使结果出现误判［10］。HRCA 扩增技术只特异性地扩增锁式探针，模板DNA 只起到让线性锁式探针环化的作用。因此，在HRCA 扩增技术体系中，模板DNA 不会富集，避免了PCR 方法中靶标DNA 富集的影响。

在细菌的分子生物学检测中，常利用细菌相对保守的16S rDNA 碱基序列来设计引物，进行细菌种类的检测和鉴定。对于种间差别较大的细菌可以用该方法检测和鉴定，但对于相似种或是种以下的不同race 型则很难，因为它们的16S rDNA 碱基序列几乎相同。香蕉细菌性枯萎病菌相似的race 型有5 种，因此本研究采用香蕉细菌性枯萎病菌独有的插入序列ISRso19 部分碱基作为模板，用HRCA 扩增技术对该菌进行研究，实现了香蕉细菌性枯萎病菌HRCA 特异性扩增，灵敏度可达500 fg·μL-1，高于常规PCR 一个数量级。

在基层口岸植物检疫实验室，往往都存在着缺乏仪器设备的客观情况，而基于锁式探针的HRCA 扩增技术对仪器设备要求不高，一般的口岸分支植物检疫实验室都能具备，便于口岸应用。另外，锁式探针最大优势是高通量，可以与荧光PCR 技术、反向斑点杂交技术、DNA 芯片等技术结合［11，12］，尤其是结合DNA 芯片技术，可同步检测多种病原微生物。在我国进境的植物中，往往存在着多种病原微生物，利用基于锁式探针的扩增技术与DNA 芯片技术结合起来，可实现同种植物产品上多种病原有害生物的同步检测，这对于提高口岸疫情把关，有效防止外来有害生物传入，保护国内农林业和生态安全都具有重要意义。

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