Ezrin和P53在结直肠癌中的表达及临床病理意义

王昕炜，丁小英，樊祥山，恽 艳，刘元华

（1.江苏省肿瘤医院内科，江苏南京210009；2.中国药科大学临床药学教研室，江苏南京210009；3.南京大学医学院附属鼓楼医院病理科，江苏南京210008；4.武进区妇幼保健计划生育服务中心，江苏常州213159）

Ezrin和P53在结直肠癌中的表达及临床病理意义

王昕炜1，丁小英2，樊祥山3，恽 艳4，刘元华1

（1.江苏省肿瘤医院内科，江苏南京210009；2.中国药科大学临床药学教研室，江苏南京210009；3.南京大学医学院附属鼓楼医院病理科，江苏南京210008；4.武进区妇幼保健计划生育服务中心，江苏常州213159）

目的 探讨Ezrin和P53在结直肠癌中的表达及意义。方法 应用组织芯片和免疫组织化学技术检测109例结直肠癌组织中Ezrin和P53蛋白表达，并应用统计学方法分析Ezrin和P53表达水平与结直肠癌各种临床病理特征的关系及二者相关性。结果 Ezrin蛋白在结直肠癌组织中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率[89.55%（60/67）]高于Ⅰ、Ⅱ期组[23.81%（10/42）]，低分化、未分化组表达阳性率[94.44%（17/18）]高于高分化、中分化组[58.24%（53/91）]，T3、T4组阳性率[67.31%（70/104）]高于T1、T2组[0（0/5）]，有淋巴结转移组表达阳性率[89.55%（60/67）]高于无淋巴结转移组[23.81%（10/42）]，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其表达与性别、年龄无关。P53在结直肠癌中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率[53.73%（36/67）]高于Ⅰ、Ⅱ期组[23.81%（10/42）]，低分化、未分化组表达阳性率[72.22%（13/18）]高于高分化、中分化组[36.26%（33/91）]，有淋巴结转移组表达阳性率[53.73%（36/67）]高于无淋巴结转移组[23.81%（10/42）]，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其表达与性别、年龄、浸润深度无关。结直肠癌组织中Ezrin表达与P53无关（r=0.212，P＞0.05）。结论 应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、方便、经济、准确等特点。Ezrin蛋白可能是预测结直肠癌转移的有用指标；联合检测Ezrin、P53蛋白可作为判断结直肠癌预后和筛选高危结直肠癌转移患者的有效指标，有助于结直肠癌预后的判断。

结直肠肿瘤； 基因，p53； 免疫组织化学； Ezrin； 组织芯片

结直肠癌是人类常见恶性肿瘤之一，在我国发病率及死亡率高居前列，并呈明显上升趋势。侵袭和转移是影响患者预后的重要因素。Ezrin基因是一种肿瘤转移相关基因，Ezrin蛋白参与了恶性肿瘤的侵袭和转移过程。本研究对结直肠癌组织芯片应用免疫组织化学（免疫组化）方法检测Ezrin及P53蛋白表达，研究其与临床病理特征（如癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移和TNM分期等）的关系，探讨结直肠癌Ezrin蛋白表达与P53的关系，分析其在结直肠癌侵袭和转移中的作用，旨在为临床诊治和预后判断提供新的理论依据。

1 资料与方法

1．1 资料

1.1.1 标本收集 收集江苏省肿瘤医院病理科及南京大学医学院附属鼓楼医院病理科2003～2007年存档的结直肠癌标本109例。109例患者中男62例，女47例；年龄30～86岁，平均（61.53±11.79）岁，中位年龄62.0岁。

1．1.2 主要仪器与试剂 P53兔抗人单克隆抗体购自Zymed公司，Ezrin鼠抗人单克隆抗体购自Lab Vision/ Neomarkers公司，二抗（Envision两步法鼠/兔通用型试剂盒K5007）购自DAKO公司，蜂蜡购自上海华灵公司，组织微列阵打孔仪购自美国Beecher instrument公司。

1.2 方法

1.2.1 构建组织芯片 对109例苏木精-伊红染色切片重新读片，在蜡块上圈定典型肿瘤病变部位。使用美国Beecher instrument公司组织微阵列打孔仪在蜡块（空白）打孔，然后在结直肠癌病例蜡块的圈定位置穿刺取得大小现状与已打孔相同的蜡柱，再置入空白蜡块的孔内，即成组织芯片蜡块。对组织芯片蜡块进行连续切片40～60张，每张切片厚度4 μm，将制作的切片保存于-20℃冰箱备用。

1.2.2 P53、Ezrin测定 对组织芯片进行Envision两步法免疫组化染色，实验步骤按试剂盒说明书操作，每次试验均设阳性对照和阴性对照。每项检测指标均在另一张组织芯片上重复1次。由2名病理医生采用双盲法阅片判定免疫组化检测结果。

1.2.3 免疫组化检测结果判定 Ezrin蛋白阳性表达部位为细胞质和（或）细胞膜，呈黄色颗粒。P53蛋白阳性表达部位为细胞核，呈黄色或黄褐色颗粒。根据肿瘤细胞染色强度进行评分：无色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。按肿瘤细胞阳性百分比评分：＜5%、5%～＜25%、25%～＜50%、50%～75%、＞75%分别计0、1、2、3、4分。最终染色结果为染色强度评分与阳性细胞百分比评分的乘积，总分最高为12分，最低为0分；0分计为阴性；1～3分记为弱阳性（1+）；4～7分记为阳性（2+），8～12分记为强阳性（3+）。将阴性、弱阳性视为阴性表达，阳性、强阳性视为阳性表达。

1.3 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行数据分析。计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验；Spearman秩相关分析采用Fisher′s检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ezrin、P53表达阳性率与临床病理特征的关系Ezrin蛋白在结直肠癌组织中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期组，低分化、未分化组表达阳性率高于高分化、中分化组，T3、T4组表达阳性率高于T1、T2组，有淋巴结转移组表达阳性率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其表达与性别、年龄无关。P53在结直肠癌组织中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期组，低分化、未分化组表达阳性率高于高分化、中分化组，有淋巴结转移组表达阳性率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其表达与性别、年龄、浸润深度无关，见表1。

2．2 Ezrin表达与P53的关系 70例Ezrin蛋白表达阳性患者中P53蛋白表达阳性35例，39例Ezrin蛋白表达阴性患者中P53蛋白表达阴性28例，Ezrin表达与P53无关（r=0.212，P＞0.05）。

表1 Ezrin、P53表达阳性率与临床病理特征的关系（n=109）

3 讨 论

组织芯片是在同一张载玻片上将数百或数十枚小圆柱形组织蜡块样本规整地排列而制成的微缩组织切片，组织芯片优点：（1）体积小；（2）样本量大，一张芯片可包含数十至上百个样本；（3）高通量，一次实验即可获得大量数据结果。该技术目前已被广泛应用于肿瘤研究。本研究制作的每张结直肠癌组织芯片上有104个样品，仅用几张芯片即完成研究，降低了工作强度及人力成本，大幅度节约了研究经费，圆满、快速地获得了本研究所需的全部数据。因此，本研究再次证实了在大规模临床组织样本检测中组织芯片简便、高效，其与传统病理切片比较，准确度不亚于传统病理切片，具有高通量、便捷、费用低廉等特点。

肿瘤转移包括多个步骤如细胞侵入基底膜、扩散到淋巴结或血管及在远处生长等，在这些过程中肿瘤细胞发生形态改变，肌动蛋白细胞骨架作用在此过程中非常重要[1]。Ezrin是膜-细胞骨架连接蛋白，是ERM（Ezrin/Radixin/Moesin）蛋白家族成员，其通过与膜蛋白（如E-钙黏附蛋白/β-连环蛋白）与肌动蛋白细胞骨架连接，进而连接肌动蛋白细胞骨架与细胞膜，调节细胞与细胞间及细胞与基质间的黏附，在细胞形态调节和细胞运动中发挥重要作用[2]。在恶性肿瘤中Ezrin通过与肿瘤细胞表面黏附分子发生作用调节肿瘤细胞特性，影响肿瘤的分化、侵袭和转移[3]。有研究表明，Ezrin在肿瘤侵袭与转移过程中具有重要作用，在多种肿瘤中如骨肉瘤[4]、胰腺癌[5]、肝细胞癌[6]及舌鳞癌[7]等 Ezrin高表达与肿瘤转移相关，与疾病预后呈负相关。Yu等[8]研究了乳腺癌组织中Ezrin表达与E-cadherin表达的相关性发现，Ezrin高表达且E-cadherin低表达组与淋巴结转移密切相关；Ezrin高表达且E-cadherin低表达组Ezrin表达与E-cadherin表达呈负相关，Ezrin是乳腺癌的独立预后因子。Ezrin促进肿瘤转移的作用是通过下调E-cadherin表达实现的。乳腺癌细胞系高表达Ezrin促进肿瘤转移[9]。应用小干扰RNA敲除Ezrin可逆转乳腺癌细胞系的转移[10]。

本研究发现，Ezrin蛋白在结直肠癌组织中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期组，低分化、未分化组表达阳性率高于高分化、中分化组，T3、T4组表达阳性率高于T1、T2组，有淋巴结转移组表达阳性率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P<0.05）；其表达与性别、年龄无关。与上述在其他恶性肿瘤中的研究结果一致，表明Ezrin高表达是结直肠癌发展、侵袭和转移的密切相关因素，Ezrin高表达可预示结直肠癌有较高的侵袭性和不良预后。

P53基因是人体抑癌基因之一。正常情况下野生型P53参与了细胞周期调控，是抑癌基因，对细胞增殖具有负调控作用，维持机体平衡状态。在结直肠癌发生中P53基因也是最常发生突变的基因[11]，当P53基因发生突变时即失去抑癌作用，就会丧失对细胞分裂、增殖的负向调控作用，突变型P53基因不能抑制细胞增殖，使细胞恶性转化能力和侵袭性增强，导致肿瘤的发生[12]。P53蛋白主要集中于核仁区。野生型P53由于半衰期短，在组织、细胞中含量极少，通过免疫组化方法检测的是突变型P53蛋白表达情况，即表明P53基因发生了突变。P53过度表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关已得到证实，肿瘤组织中P53蛋白过度表达证明肿瘤有较强的侵袭力和转移力，提示预后不佳。另外P53表达与放疗敏感性显著相关，其在调节肿瘤细胞放疗反应中发挥了重要作用，可作为放疗敏感相关基因[13]。因此，检测P53蛋白可作为判断结直肠癌严重程度、预后及指导治疗的一项重要指标。本研究发现，P53在结直肠癌中高表达，TNM分期Ⅲ、Ⅳ期组表达阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期组，低分化、未分化组表达阳性率高于高分化、中分化组，有淋巴结转移组表达阳性率高于无淋巴结转移组，差异均有统计学意义（P<0.05）；其表达与性别、年龄、浸润深度无关，T1、T2组只有5例患者，病例数太少可能是未检出P53与浸润深度相关的原因，但进一步证实了P53蛋白过度表达的结直肠癌有较强的侵袭力和转移力，提示预后不佳。

有研究发现，在乳腺癌[14]及膀胱癌[15]中 Ezrin表达与P53无关。而结直肠癌中Ezrin表达与P53的关系仍不清楚，本研究探讨了结直肠癌Ezrin表达与P53的相关性，结果显示，Ezrin表达与P53无关，表明其在结直肠癌的发生、转移和浸润过程中可能不存在相互影响，不具有协同作用。

总之，结直肠癌组织中Ezrin、P53表达上调，与结直肠癌发生、发展密切相关。Ezrin、P53表达阳性患者淋巴结转移率高，肿瘤分化程度低，提示预后不良。联合检测结直肠癌组织P53、Ezrin蛋白表达可帮助判断肿瘤严重程度、有效评价预后并可指导术后治疗。

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Expression and clinicopathologic significance of Ezrin and P53 in colorectal carcinoma

Wang Xinhui1，Ding Xiaoying2，Fan Xiangshan3，Yun Yan4，Liu Yuanhua1
（1.Department of Internal Medicine，Jiangsu Provincial Tumor Hospital，Nanjing，Jiangsu 210009，China；2.Teaching and Researching Section of Clinical Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing，Jiangsu 210009，China；3.Department of Pathology，Affiliated Gulou Hospital，Medical College of Nanjing University，Nanjing，Jiangsu 210008，China；4.WujinDistrictMaternalandChildHealthCareFamilyPlanningServiceCenter，Changzhou，Jiangsu213359，China）

ObjectiveTo study the expression levels of Ezrin and P53 in colorectal carcinoma and their clinicopathological significance.MethodsThe tissue microarray and immunohistochemical staining technology were used to detect the expression of Ezrin and P53 in 109 cases of colorectal carcinoma tissues.The correlation between Ezrin and P53 expressions and their relation with the clinicopathological characteristic of colorectal carcinoma were analyzed by using the statistical method.ResultsThe Ezrin protein was highly expressed in the colorectal carcinoma tissues，the positive expression rate in the TNM stageⅢ，Ⅳgroup was 89.55%（60/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the TNM stageⅠ，Ⅱgroup，the expression positive rate in the low differentiation and non-differentiation group was 94.44%（17/18），which was higher than 58.24%（53/91）in the high and middle differentiation group，the positive rate in the T3，T4 group was 67.31%（70/104），which was higher than 0 （0/5）in the T1，T2 group，the positive rate in the lymph node metastasis group was 89.55%（60/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the non-lymph node metastasis group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；its expression had no relation with the sex and age.P53 was highly expressed in the colorectal carcinoma tissues，the expression positive rate in the TNM stageⅢ，Ⅳgroup was 53.73%（36/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the TNMstageⅠ，Ⅱgroup，the positive rate in the low differentiation and non-differentiation group was 72.22%（13/18），which was higher than 36.26%（33/91）in the high and middle differentiation group，the positive rate in the lymph node metastasis group was 53.73%（36/67），which was higher than 23.81%（10/42）in the non-lymph node metastasis group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；its expression had no relation with the sex，age and infiltration degree.The Ezrin expression in the colorectal carcinoma had no relation with P53（r=0.212，P＞0.05）.ConclusionApplying the tissue microarray for efficiently detecting clinical tissue samples in large scale is feasible and has the advantages of rapidness，convenience，economy and accuracy.The Ezrin protein may be a useful indicator for predicting the metastasis of colorectal carcinoma；the combined detection of Ezrin and P53 may serve as an effective indicator for judging the prognosis of colorectal carcinoma and screening the metastasis of colorectal carcinoma，which is conducive to the judgment of colorectal carcinoma prognosis.

Colorectal neoplasms； Genes，p53； Immunohistochemistry； Ezrin； Tissue microarrays

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.001

A

1009-5519（2015）24-3689-03

2015-09-25）

国家自然科学基金资助项目（81101815）。

王昕炜（1978-），男，江苏无锡人，主治医师，主要从事肿瘤内科治疗的研究；E-mail：wxwswy@163.com。

刘元华（E-mail：yuanhualiu02@hotmail.com）。