小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

唐伟　程德杰　魏娇等

摘要：通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）的衣壳蛋白（CP）基因，将其连接原核表达载体pEHISTEV，并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，经IPTG诱导后，可以表达38 kD的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白，免疫新西兰长耳兔，制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048，Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应，而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。

关键词：小麦黄花叶病毒；外壳蛋白；原核表达；抗血清；检测

中图分类号：S512.1：Q786 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2015）01-0088-04

Abstract The coat protein （CP） gene of wheat yellow mosaic virus （WYMV） was amplified by RT-PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pEHISTEV to produce recombinant plasmid pEHISTEV-WYMVCP. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli strain Rosetta and expressed a 38 kD fusion protein after inducing by IPTG. The fusion protein was collected as antigen to immunize rabbits for production of polyclonal antiserum against WYMV CP. Finally the polyclonal antiserum was obtained with titer above 1∶2 048 by ELISA. With this antiserum， the WYMV CP in the infected wheat plant could be detected specifically by Western blotting. The resultant antibody will facilitate the detection of WYMV and the functional studies of WYMV CP.

Key words Wheat yellow mosaic virus； Coat protein； Prokaryotic expression； Antiserum； Detection

小麦黄花叶病是由马铃薯Y病毒科（Potyviridae）大麦黄花叶病毒属（Bymovirus）的小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）引起的[1]。自20世纪70年代中国报道小麦黄花叶病以来，在长江中下游、黄淮流域、四川盆地等小麦产区均有该病害的报道[2～8]。近年来，由于感病品种的大面积种植等原因，该病日趋严重，现全国发病面积达200×104 hm2， 每年减产在15×108 kg以上[9]。

WYMV为二分体正单链RNA病毒，病毒粒子弯曲线状，有250～300 nm和550～700 nm两种长度。WYMV以土壤中的禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L.）为介体进行传播，侵染小麦造成危害。病毒在秋后即可侵染小麦，但不显症；在小麦返青期，叶片上产生花叶或者梭条形病斑，植株矮化。当气温超过20℃时，病株隐症。发病植株在成熟期表现为麦穗短小，籽粒不饱满，产量下降[10，11]。

病毒的衣壳蛋白（Coat protein，CP）是具有多种功能的结构蛋白，在病毒生活史的各个阶段中具有重要的功能[12，13]；此外，病毒的CP能够和病毒其他蛋白进行互作共同行使某种功能，如症状表现[14，15]、病毒粒子装配、病毒传播[16，17]、复制[18]、RNA转录[19]、移动[13， 20]、抑制寄主的RNA沉默[21，22]以及激活R基因调节的寄主抗性[23]等。

本研究在对山东小麦黄花叶病毒分子检测的基础上，利用RT-PCR的方法，扩增获得WYMV CP基因，构建了原核表达载体并在大肠杆菌中高效表达，通过免疫家兔制备了相应的特异性抗血清，为WYMV检测以及WYMV CP基因功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株Escherichia coli DH5α、Rosetta（DE3）及原核表达载体pEHISTEV均由本实验室保存；Taq DNA聚合酶、pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司； TransZol、反转录和PCR产物回收试剂盒、SDS-PAGE所用蛋白Marker购自TransGen公司；硝酸纤维素膜为Pall Gelman公司产品；碱性磷酸酯酶标记的鼠抗兔IgG、福氏不完全佐剂购自Sigma公司；Western blotting所用蛋白Marker购自Thermo公司；IPTG、DTT、KCl等为国产分析纯。

1.2 引物设计及WYMV CP基因的克隆

根据2012年丛倩倩获得的WYMV CP基因序列[24]设计PCR引物。正向引物为WYMV-CP-NcoⅠ-F（5′-CTA GCC ATG GCA GCT GAC ACA C-3′），反向引物为WYMV-CP-SalⅠ-R（5′-GCG TCG ACT TAG GTT AGT TCT GG-3′）。endprint

以山东泰安采集的WYMV病株为材料，参照TransZol试剂盒说明，从新鲜病株提取总RNA。以提取的总RNA为模板， 在引物Oligo（dT）18引导下利用反转录试剂盒合成第一链cDNA，进行PCR。PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，使用PCR凝胶回收试剂盒回收目的片段。连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆进行测序。

1.3 cp基因原核表达载体构建及表达

将获得的目的片段经NcoⅠ和SalⅠ双酶切后，与经过相同酶切处理的pEHISTEV进行连接，转化大肠杆菌DH5α。将经PCR扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒（pEHISTEV-WYMVCP）转化大肠杆菌Rosetta。挑取单斑接种到3 mL含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃活化过夜。取200 μL 培养过夜的菌液放入20 mL（1∶100）含50 mg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃、220 r/min振荡培养至OD600值为0.4～0.6，加入终浓度为0.4 mmol/L IPTG诱导4～6 h，离心收集菌体。加适量TE缓冲液（pH 8.0）振荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min。SDS-PAGE电泳检测表达情况。

1.4 抗血清制备、效价及特异性测定

从凝胶上直接回收表达的蛋白条带[25]，用适量生理盐水稀释后，加入等体积的福氏不完全佐剂进行乳化，采用皮下注射法免疫新西兰长耳兔。每隔1周注射1次，共5次。最后一次注射1周后采血，收集抗血清，分装后-20℃贮存。利用ELISA测定抗血清的效价，Western blotting分析抗血清的特异性。

2 结果与分析

2.1 WYMV CP基因克隆及原核表达

通过RT-PCR从病株中扩增到一条特异的900 bp左右的DNA片段（图1），与预期大小相符。克隆后测序发现其大小为882 bp，Blast结果表明该片段为WYMV cp基因。

将该基因酶切、连接到原核表达载体pEHISTEV的多克隆位点，获得重组质粒pEHISTEV-WYMVCP，转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导后取菌体进行SDS-PAGE电泳，发现在38 kD左右出现一条特异性蛋白条带（图2），与预期大小一致，说明外源蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达。利用BandScan5.0检测蛋白的表达量，发现pEHISTEV-WYMVCP目的蛋白的相对表达量占菌体总蛋白的34.0%。

2.2 抗血清制备及特异性检测

将切胶回收的蛋白条带乳化后免疫家兔，注射5次后获得WYMV CP抗血清。以WYMV侵染的小麦和健康小麦为材料，用获得的抗体进行Western blotting检测。结果显示WYMV侵染的小麦样品在38 kD处出现了特异性的条带，而健康小麦样品无特异性免疫反应（图3），说明以原核表达的WYMV CP蛋白为抗原制备的抗血清能够特异地与病株中WYMV CP蛋白结合。

2.3 抗血清的效价

以健康小麦样品为阴性对照，以WYMV侵染的小麦样品为材料，使用间接ELISA测定抗体效价。结果显示，该抗体的效价可以达到1∶2 048（表1），表明该抗体效价相对较高。

3 结论与讨论

病毒CP蛋白涉及病毒生活史的各个阶段，在病毒粒子形成与病毒生物学中发挥作用

[12，13]。近年来的研究发现，WYMV的CP蛋白在其VPg蛋白核质穿梭过程中具有重要作用[26]。

在制备抗血清过程中，由于有些植物病毒在植株体内含量较低，不易获得大量的抗原，提纯的病毒粒子外壳蛋白容易在纯化的过程中丢失，而且利用传统的病毒提纯方法无法完全去除寄主植物蛋白，制备的抗血清易产生假阳性。利用原核表达的方法可以在短时间内获得大量目的蛋白，成为制备抗血清常用的方法。向荣[27]、杨狄[28]等利用原核表达方法获得WYMV P1、P2蛋白，并成功获得WYMV抗血清。韩成贵等利用pET-30a（+）载体表达了WYMV CP融合蛋白，其N-端包含55个载体氨基酸，制备的血清成功用于小麦黄花叶病的检测[29，30]。

本研究利用了pEHISTEV原核表达载体，所表达的蛋白仅包含25个非病毒蛋白氨基酸。利用原核表达获得的CP蛋白免疫家兔获得了效价为1∶2 048的WYMV抗血清，该血清与病株中的WYMV CP有特异反应，而与健康植株无反应，说明制备的抗体有较高的效价和良好的特异性，可用于WYMV样品的ELISA和Western blotting检测。在Western blotting检测病株叶片时，还出现了小于38 kD的条带，这可能是由于寄主叶片细胞的衰老，导致病毒CP蛋白的水解。类似情况也在小麦条纹花叶病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）CP蛋白的检测中出现[31，32]。

抗血清的制备对检测小麦黄花叶病的发生、明确小麦黄花叶病原以及预测预报具有积极作用，为深入研究CP功能奠定了基础。

参 考 文 献：

[1]雷娟利， 陈炯，陈剑平，等. 我国真菌传线状小麦花叶病毒病病原初步鉴定为小麦黄花叶病毒（WYMV）[J]. 中国病毒学，1998，13（1）：90-97.

[2]孙炳剑， 羊健， 孙丽英，等. 禾谷多黏菌传小麦病毒病的分布及变化动态[J]. 麦类作物学报， 2011，31（5）：969-973.

[3]Han C， Li D， Xing Y，et al. Wheat yellow mosaic virus widely occurring in wheat （Triticum aestivum） in China[J]. Plant Disease，2000，84（6）：627-630.endprint

[4]阮义理， 邹皖和， 王卉. 我国真菌传大小麦病毒病的地理分布[J]. 植物保护学报， 1997，24（1）：35-38.

[5]李大伟， 韩成贵， 邢恰明， 等. 中国小麦黄花叶病毒（WYMV）分布的RT-PCR鉴定[J]. 植物病理学报， 1997，27（4）：303-307.

[6]Chen J. Occurrence of fungally transmitted wheat mosaic viruses in China[J]. Annals of Applied Biology， 1993，123（1）：55-61.

[7]罗瑞梧， 杨崇良. 山东小麦土传花叶病的研究[J]. 山东农业科学， 1982（2）：6-12.

[8]王鸣岐， 刘国士， 陆秀海. 小麦梭斑花叶病毒病在我国发生的初步证实[J]. 四川农业科技，1980（1）：34-35.

[9]陈剑平. 中国禾谷多黏菌传麦类病毒研究现状与展望[J]. 自然科学进展， 2005，15（5）：524-533.

[10]林美琛， 阮义理. 小麦黄花叶病（WYMV）的研究[J]. 植物病理学报，1986（2）：11-16.

[11]侯明生， 陈智鹏， 刘克俭. 小麦黄花叶病的初步研究[J]. 湖北农业科学， 1983（10）：25-27，41.

[12]Ivanov K I， Mkinen K. Coat proteins， host factors and plant viral replication[J]. Current Opinion in Virology， 2012，2（6）：712-718.

[13]Callaway A， Giesman-Cookmeyer D， Gillock E， et al. The multifunctional capsid proteins of plant RNA viruses[J]. Annual Review of Phytopathology， 2001，39（1）：419-460.

[14]Rao A， Grantham G L. Molecular studies on bromovirus capsid protein： II. Functional analysis of the amino-terminal arginine-rich motif and its role in encapsidation， movement， and pathology[J]. Virology，1996，226（2）：294-305.

[15]Dawson W O. Tobamovirus-plant interactions[J]. Virology，1992，186（2）：359-367.

[16]Blanc S， López-Moya J J， Wang R，et al. A specific interaction between coat protein and helper component correlates with aphid transmission of a potyvirus[J]. Virology， 1997，231（1）：141-147.

[17]Atreya C， Raccah B， Pirone T. A point mutation in the coat protein abolishes aphid transmissibility of a potyvirus[J]. Virology， 1990，178（1）：161-165.

[18]Bol J F. Replication of alfamo-and ilarviruses： role of the coat protein[J]. Annual Review of Phytopathology， 2005，43：39-62.

[19]Dreher T W， Miller W A. Translational control in positive strand RNA plant viruses[J]. Virology， 2006，344（1）：185-197.

[20]Carrington J C， Kasschau K D， Mahajan S K，et al. Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants[J]. The Plant Cell， 1996，8（10）：1669-1681.

[21]Wang M B， Metzlaff M. RNA silencing and antiviral defense in plants[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2005，8（2）：216-222.

[22]Qu F， Ren T， Morris T J. The coat protein of turnip crinkle virus suppresses posttranscriptional gene silencing at an early initiation step[J]. Journal of Virology， 2003，77（1）：511-522.

[23]Soosaar J L， Burch-Smith T M， Dinesh-Kumar S P. Mechanisms of plant resistance to viruses[J]. Nature Reviews Microbiology， 2005，3（10）：789-798.endprint