乳腺癌中神经激肽受体的表达及受体拮抗剂的作用研究*

2015-07-18周云丽王萌仝颖娜刘晓彬董冬邵洁

中国肿瘤临床 2015年24期

周云丽王萌仝颖娜刘晓彬董冬邵洁

·临床研究与应用·

周云丽王萌仝颖娜刘晓彬董冬邵洁

目的：研究乳腺癌中全长型、截短型神经激肽1受体（neurokinin 1 receptor，NK1R）和神经激肽2受体（neurokinin 2 re⁃ceptor，NK2R）的表达，及受体拮抗剂对乳腺癌细胞生长的影响。方法：采用免疫组织化学法检测天津医科大学肿瘤医院51例乳腺癌及其癌旁正常组织、30例乳腺良性病变组织总NK1R（包括NK1R-FL和NK1R-Tr）和NK2R表达，采用实时定量PCR和免疫印迹技术检测乳腺细胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R表达，建立NK1R-FL和NK1R-Tr过表达的乳腺细胞系,在NK1R和NK2R拮抗剂作用下测定细胞增殖和软琼脂集落形成能力。结果：乳腺癌及癌旁正常组织、乳腺良性病变组织中均总NK1R过表达，乳腺癌组织中NK1R-FL、NK2R表达相比癌旁正常组织显著降低，并与乳腺癌分型、组织学分级、淋巴结转移及Ki-67、HER-2、ER和PR表达相关。HBL-100细胞中NK1R-FL和NK2R过表达、NK1R-Tr低表达，MDA-MB-231、T-47D和MCF-7细胞中只表达NK1R-Tr。乳腺癌细胞中NK1R-Tr低表达、NK1R-FL表达增加其对NK1R和NK2R受体拮抗剂的敏感度。结论：乳腺组织中NK1R-FL、NK2R共表达，乳腺癌细胞中NK1R-Tr过表达并负反馈调节NK1R-FL和NK2R的表达，NK1R和NK2R受体可能成为乳腺癌治疗的新靶标。

乳腺癌神经激肽1受体神经激肽2受体拮抗剂

速激肽是C末端有-Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2共同结构肽的总称［1］。哺乳动物的速激肽主要包括P物质（substance P，SP）、神经激肽A（neurokinin A，NKA）、神经激肽B（neurokinin B，NKB）等。速激肽通过与其受体相结合发挥生物学作用，速激肽受体分为NK1R-SP、NK2R-NKA、NK3R-NKB三种敏感类型。NK1R广泛分布于中枢和外周组织，NK2R主要存在于外周组织。人NK1R基因由5个外显子组成，目前在人体组织中的mRNA和蛋白水平上所发现的NK1R变异体只有全长型受体（NK1R-full length，NK1R-FL）和C-末端缺乏96个氨基酸残基的截短型受体（NK1R-truncted，NK1RTr）［2-3］。SP能够以直接和间接等多种方式参与肿瘤细胞的增殖、浸润和转移，研究显示这一促肿瘤特性是通过与NK1R-Tr而非NK1R-FL的相互作用实现的［4-5］。NK2R在结肠等组织中与NK1R共表达，并在肿瘤细胞中显示出了相反的作用［6］。本研究目的一是检测乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中NK1R、NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R的表达；二是通过将克隆的NK1R-FL和NK1RTr基因分别稳定转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和非肿瘤源性的乳腺细胞系，评价NK1R和NK2R受体拮抗剂对乳腺癌细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样本 51例乳腺癌及癌旁正常组织、30例乳腺良性病变组织来源于天津医科大学肿瘤医院术后患者，其临床病理资料见本课题组前期研究［7］。

1.1.2 细胞 MDA-MB-231为高转移性的乳腺癌细胞系，T47D和MCF-7为ER阳性的乳腺癌细胞系，SK-BR-3为HER-2阳性的乳腺癌细胞系，HBL-100为非肿瘤源性的乳腺上皮细胞系，均为天津医科大学肿瘤医院中心实验室保存。

1.1.3 试剂兔NK1R的N-末端多克隆抗体购自美国Novus公司；SP、NK2R受体拮抗剂L-117、β-actin单克隆抗体和NK1R的C-末端多克隆抗体均购自美国Sigma-Aldrich公司；兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；羊抗鼠和抗兔的HRP标记的IgG购自英国Upstate公司；化学发光检测试剂盒购自英国KPL公司；DMEM/F12培养基和胎牛血清购自美国Hyclon公司；NK1R受体拮抗剂ASN-1377642购自德国Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测 NK2R的检测材料、方法、结果判断与前期的NK1R和NK1R-FL研究相同［7］，NK2R特异性一抗工作浓度为1∶200。

1.2.2 过表达稳定株的建立和细胞培养 MDAMB-231细胞中的NK1R-FL和HBL-100细胞中的NK1R-Tr过表达稳定株建立的方法参见本课题前期研究［7］。所有细胞采用DMEM/F12培养液在37℃、5%CO2条件下培养。

1.2.3 实时定量PCR PCR扩增条件为95℃15 s、51～58℃（根据各基因不同）15 s、72℃ 45 s，共进行40个循环，PCR引物见表1。目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔCt（标准基因）-ΔCt（目的基因）。

1.2.4 Western blot检测 NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R蛋白表达的方法参见本课题前期研究［7］。

1.2.5 细胞增殖作用的检测检测NK1R和NK2R受体拮抗剂对乳腺癌细胞增殖作用。将对数生长期MDA-MB-231（野生型组）、空载体转染MDA-MB-231-C2细胞（空载体对照组），MDA-MB-231-NK1RFL稳定过表达细胞，HBL-100（野生型组）、空载体转染HBL-100-C2（空载体对照组）细胞及HBL-100-NK1R-Tr稳定过表达细胞接种于96孔细胞培养板中孵育24 h，每孔分别加入NK1R或NK2R受体拮抗剂，使其终浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0μmol/L，作用5min后加入1×10-7mol/L的SP培养48 h。每孔加入MTS工作液，孵育2 h，492 nm处检测OD值，计算细胞生长抑制率。生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.6 软琼脂集落形成实验取MDA-MB-231-NK1R-FL、HBL-100-NK1R-Tr及其野生型和空载体对照细胞，使NK1R和NK2R受体拮抗剂在细胞培养液中的终浓度均为15μmol/L，预处理5min后加入1×10-7mol/L的SP。将细胞均匀滴加到已用细胞培养液制备的终浓度为0.5%受体拮抗剂底层琼脂糖凝胶上，培养15天后倒置显微镜下计数上下左右中5个不同视野下50个以上的细胞集落形成数。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0统计软件处理数据。多组数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较用Student-Newman-Keuls法，临床病理变量和NK1R的分析采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

表1 实时定量PCR引物Table1 Real-timequantitative PCR primers

2 结果

2.1 乳腺癌、癌旁正常组织及乳腺良性病变组织中总NK1R、NK1R-FL和NK2R的表达

NK1R的N-末端抗体检测总NK1R（包括NK1RFL和NK1R-Tr）表达，NK1R的C-末端抗体检测NK1R-FL表达，考虑因NK1R-Tr表达差异造成。结果显示乳腺癌、癌旁正常组织及乳腺良性病变组织中总NK1R表达差异无统计学意义，且总NK1R表达与乳腺癌分型、组织学分级、有无淋巴结转移以及ER、PR、HER-2、Ki-67等临床病理因素均无关。乳腺癌组织中NK1R-FL和NK2R的表达较癌旁正常组织显著降低，其中浸润性导管癌下降较为显著；NK1R-FL和NK2R的表达随组织学分级升高而逐渐降低；NK1R-FL和NK2R表达的淋巴结转移者均低于无转移者；NK1R-FL和NK2R表达的ER和PR阴性者显著低于阳性者；NK1R-FL和NK2R表达的Ki-67、HER-2阴性者显著高于阳性者。虽然NK2R表达情况与NK1R-FL相似，但在大多数的样本中表达低于NK1R-FL（图1，表2）。

2.2 不同乳腺细胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R的mRNA和蛋白表达

乳腺细胞系中 NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R 的mRNA和蛋白测定显示：HBL-100细胞中NK1R-FL和NK2R的mRNA和蛋白相对高表达；MDA-MB-231、T-47D和MCF-7细胞中仅NK1R-Tr的mRNA和蛋白表达（图2）。

2.3 NK1R-FL或NK1R-Tr稳定过表达对MDA-MB-231和HBL-100细胞中NK2R的蛋白表达影响

与未转染和空载体转染的MDA-MB-231细胞相比，MDA-MB-231-NK1R-FL稳定过表达细胞中NK2R的蛋白表达明显升高，NK1R-FL过表达上调NK2R表达；与未转染和空载体转染的HBL-100细胞相比，HBL-100-NK1R-Tr稳定过表达细胞中NK2R的蛋白表达明显下降，NK1R-Tr过表达下调NK2R表达（图3）。

2.4 受体拮抗剂对NK1R-FL或NK1R-Tr稳定过表达细胞增殖的影响

NK1R受体拮抗剂随浓度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL稳定过表达细胞在体外的增殖，不同浓度下的抑制率均高于野生型和空载体对照组；HBL-100-NK1R-Tr稳定过表达细胞随浓度升高抑制率升高，但不同浓度下的抑制率均低于野生型和空载体对照组。NK2R受体拮抗剂随浓度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL稳定过表达细胞在体外的增殖，不同浓度下的抑制率与野生型和空载体对照组比较均升高，但在低浓度下具有显著性差异；HBL-100-NK1R-Tr稳定过表达细胞随浓度升高抑制率升高，但不同浓度下的抑制率均低于野生型和空载体对照组（图4）。

2.5 受体拮抗剂对NK1R-FL或NK1R-Tr稳定过表达细胞软琼脂集落形成的影响

MDA-MB-231-NK1R-FL稳定过表达细胞在无拮抗剂、NK1R和NK2R受体拮抗剂条件下，软琼脂集落形成能力均显著低于野生型和空载体对照组；HBL-100-NK1R-Tr稳定过表达细胞在无拮抗剂条件下软琼脂集落形成能力高于野生型和空载体对照组，而NK1R和NK2R受体拮抗剂条件下集落形成能力则均显著高于野生型和空载体对照组（图5）。

图1 免疫组织化学检测乳腺组织中总NK1R、NK1R-FL和NK2R表达（SP×100）Figure l TotalNK1R,NK1R-FL,and NK2R expression in breast tissuesdetected with immunohistochemistry（SP×100）

表2 乳腺组织中总NK1R、NK1R-FL和NK2R 表达Table 2 Total NK1R, NK1R-FL, and NK2R expression levels in breast tissues

图2 乳腺细胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R的mRNA和蛋白表达Figure2 Detection ofNK1R-FL,NK1R-Tr,and NK2RmRNA and protein expression levels in breastcell lines

图3 稳定转染NK1R-FL或NK1R-Tr的乳腺细胞中NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R的蛋白表达Figure 3 NK2R,NK1R-FL,and NK1R-Tr protein expression in breastcell linesstably transfected with NK1R-FL or NK1R-Tr

图4 受体拮抗剂对NK1R-FL或NK1R-Tr稳定过表达细胞增殖的影响Figure4 Effectof receptorantagoniston the proliferation ofcellsstably transfectedwith NK1R-FL/NK1R-Tr

3 讨论

速激肽受体属于跨膜7次的G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCR），在中枢和外周神经系统中作为兴奋型的神经递质引起高血压、血管平滑肌收缩、增加血管渗透性、参与免疫和炎症应答、刺激内分泌和外分泌腺分泌［8-10］。目前已有研究证实，GPCR在乳腺癌［11］等多种疾病中表达异常。NK1R-FL和NK1R-Tr两种受体由于其胞内段的不同，具有不同的细胞内信号转导特点，相较于NK1RFL伴随着G蛋白偶联功能的下降，NK1R-Tr与其配体SP的亲和性下降了近十倍，受体失去内化和脱敏的自分泌调节，延长了与配体的作用时间，因此在乳腺癌的进展中两种形式的NK1R可能起着不同的作用。本研究结果显示，随着乳腺癌的进展，乳腺癌组织中NK1R-FL和NK2R的表达逐渐降低，而NK1RTr表达则逐渐升高；NK1R-FL和NK2R在正常乳腺组织中呈共表达，在乳腺癌的进展中NK1R-FL、NK2R与NK1R-Tr可能存在负反馈调节关系。实时定量PCR和免疫印迹法表达结果印证了MDA-MB-231细胞中NK1R-FL表达上调NK2R的mRNA和蛋白表达；而HBL-100细胞中NK1R-Tr过表达则下调NK2R表达，进一步表明乳腺细胞中NK1R-FL、NK2R与NK1R-Tr可能存在负反馈调节关系。

速激肽受体在健康和疾病状态下的功能特点显示其可作为新药物的重要靶标［12-13］。SP结合NK1R后调控与肿瘤相关的生物学过程，如细胞生长增殖、血管生成、肿瘤的迁移和侵袭等。应用NK1R拮抗剂，可特异性抑制肿瘤细胞增殖、移动和血管生成［14-15］。本研究使用拮抗剂分析NK1R-FL、NK1R-Tr两种同工型与NK2R表达关系显示，NK1R-FL过表达抑制MDA-MB-231细胞的增殖，而NK1R-Tr过表达则增强HBL-100细胞的增殖。NK1R受体拮抗剂随药物浓度的升高及作用时间的延长抑制NK1R-FL过表达的MDA-MB-231和HBL-100细胞在体外的增殖和集落形成能力，并随浓度升高抑制NK1R-Tr过表达的HBL-100细胞的增殖和集落形成能力；NK2R受体拮抗剂随浓度升高抑制NK1R-FL过表达的MDAMB-231和HBL-100细胞在体外的增殖和集落形成能力。研究结果进一步显示，乳腺癌细胞中NK1RTr的表达上调可能造成NK1R-FL和NK2R的表达下调，降低NK1R、NK2R受体拮抗剂对乳腺癌细胞的作用，但NK1R和NK2R受体拮抗剂均可抑制乳腺癌细胞的生长。

本研究初步揭示了乳腺癌细胞中NK1R-FL、NK2R与NK1R-Tr的负反馈调节关系，为进一步了解三者之间的调控机制奠定了基础。NK1R、NK2R受体可能成为乳腺癌治疗的新靶点。

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（2015-10-12收稿）

（2015-12-07修回）

Expression of neurokinin receptors and the effect of their antagonistson human breast cancer

YunliZHOU,MengWANG,Yingna TONG,Xiaobin LIU,Dong DONG,Jie SHAO

YunliZHOU;E-mail:zhouyunli@tjmuch.com
Department of Clinical Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China
Thisworkwassupported by the NationalNaturalScience Foundation of China(No.81201653)

Objective:To determ ine the expression of the full-length(NK1R-FL)and truncated(NK1R-Tr)neurokinin-1 receptor(NK1R)and the neurokinin-2 receptor(NK2R)in breast cancer tissues and cell lines,aswell as to study the effects of the NK1R and NK2R antagonists on the grow th of breast cancer cells.Methods:Immunohistochem istry and Western blotassayswere used to detect NK1R,NK1R-FL,and NK2R expression in clinicalsamples of primary breast cancer tissue,benign lesions,and normalbreast tissue,as wellas in differentbreast cancer cell lines.Cell proliferation and softagar grow th testswere performed on cells treated w ith the NK1R and NK2R antagonists to study the ectopic overexpression of NK1R-FL and NK1R-Tr in breast cancer cell lines.Results:Total NK1R expression was detected in the breast cancer tissues,benign lesions,and normalbreast tissues.Compared w ith the normalbreastepithelia and benign breast lesions,the expression levels of NK1R-FL and NK2R decreased in the carcinoma.These changeswere also related to the carcinoma type,histologicalgrade,lymph nodemetastasis,HER2 and Ki-67 expression,and estrogen and progesterone receptors in breast cancer.The expression levels of NK1R-FL and NK2R were high in the HBL-100 breast cell lines of para-neoplastic tissues,butNK1R-Trexpressionwas low.TheMDA-MB-231,T-47D,and MCF-7 cellsonly expressed NK1R-Tr.NK1R-Tr or NK1R-FL overexpression caused the decreased inhibition rate or increased levels of the NK1R and NK2R antagonists in the breast cancer cells.Conclusion:NK1R-FL and NK2R are co-expressed in normal cells.NK1R-Tr ishighly expressed in breastcancer cellsand exertsnegative feedback to regulate NK1R-FL and NK2R expression in all cells,especially cancer cells.

breastcancer,neurokinin 1 receptor,neurokinin 2 receptor,antagonist