不同预处理方法对柠檬桉染色体制片技术的影响

刘思汝，林 彦，罗建中

(国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022)

不同预处理方法对柠檬桉染色体制片技术的影响

刘思汝，林 彦，罗建中＊

(国家林业局桉树研究开发中心，广东 湛江 524022)

以柠檬桉种子的根尖为研究材料,通过比较了3种浓度的秋水仙素、2 mmol·L-1的8-羟基喹啉、冰水混合物及以不同比例冰水混合物和0.1%的秋水仙素的混合液等预处理，在多个时间梯度对柠檬桉根尖染色体制片的影响进行了研究，结果发现：3种浓度秋水仙素预处理中，0.1%秋水仙素预处理1.5 h的染色体浓缩适中，分散性好，有较多的分裂相；2 mmol·L-1的8-羟基喹啉预处理的染色体均分散性较差，且分裂相较少；冰水混合物预处理12 h的染色体浓缩适中且分裂相较多，分散程度较好。其余处理时间的染色体浓缩程度不理想，不易进行染色体分析；混合液中2:3比例下的染色体分散性较好，且浓缩程度适中，有较多的分裂相，综合比较结果由优到劣的处理方法为：0.1%秋水仙素预处理1.5 h＞2:3混合液＞冰水混合物处理12 h＞2 mmol·L-1的8-羟基喹啉，其中在上午11:30—12:30取材，0.1%的秋水仙素处理根尖1.5 h，效果最佳。

柠檬桉；预处理；染色体

植物细胞的染色体制片是植物细胞学、植物分类学和植物细胞遗传学等学科不可缺少的技术，并广泛应用于植物的种质资源亲缘关系鉴定、遗传育种等方面[1]。常见的植物细胞染色体制片方法包括常规压片法[2]、去壁低渗法[3-4]和孚尔根(Feulgen)核反应染色法[5]。

桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)、伞房属(Corymbia)和杯果木属(Angophora)植物的统称，也是世界上三大速生树种之一[6]。桉树多数种自然分布于澳大利亚，只有少数几个种自然分布于印度尼西亚、巴布亚新几内亚和菲律宾地区。桉树种质资源丰富，迄今已发现900多种[7]。我国自1890年引种桉树以来，经过120多年的发展，特别是近几十年来的林业发展，桉树已在广东、广西、福建、云南、四川等地广泛种植[8]。桉树染色体数为 2 n=22[9]。目前对桉树属的染色体数目和形态学知之甚少，由于桉树的染色体较小，难以辨别桉树属的染色体数目和形态学，因而无法准确地进行染色体配对。为了能够更好地观察染色体和染色体计数，获得较多的中期分裂相，桉树根尖之前需选择合适的预处理剂以及选择适宜的条件来固定。本试验以柠檬桉(C. citrodora)根尖为材料，研究了不同预处理剂和预处理剂处理的时间2个因素对桉树染色体制片的影响，旨在为进行桉树选育种提供细胞学基础以及技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选用柠檬桉为材料，材料取自国家林业局桉树研究开发中心。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理

取一层滤纸平铺于培养皿中，把消毒后的柠檬桉种子均匀地放在滤纸上，每个培养皿中约20粒种子，加入适量的蒸馏水，28℃恒温箱黑暗培养3 ～ 4 d，待种子根尖长至0.5 ～ 1.5 cm，切取根尖进行离体处理。

1.2.2 桉树根尖细胞染色体制片

1.2.2.1 取材部位和取材时间

取材部位必须是植物生长活跃，分裂旺盛的部位[10]，一般是根尖的生长点。植物不同取材时间也有所差异，大多数植物的取材时间在早上9:00—10:00[12]，经过试验结果表明桉树宜在上午 11:30—12:30取材，此时间段具有最多处于中期分裂相细胞。

1.2.2.2 预处理试验设计

以秋水仙素、8-羟基喹啉、冰水混合物以及冰水混合物和 0.1%的秋水仙素混合分别作为预处理剂用于桉树根尖固定处理，每个处理方法分别采用5个桉树种子萌芽的根尖用于染色体制片的比较。(1)分别用0.05%、0.1%、0.2%浓度的秋水仙素处理桉树根尖1、1.5、2、3 h；(2)用2 mmol·L-1的8-羟基喹啉溶液在 8℃温度下分别处理 3、4、5 h；(3)用冰水混合物分别预处理3、6、10、12、18、24 h；(4)冰水混合物和0.1%的秋水仙素按体积比以1:1、2:3、3:2的比例混合处理2 h。

1.2.2.3 材料固定

使用Carnoy固定剂(V冰醋酸：V无水乙醇=1:3)在4℃温度下固定18 h。

1.2.2.4 解离

将固定好的材料用超纯水冲洗 30 min，每 10 min冲洗1次，然后材料在1 mol·L-1的盐酸60℃的水浴锅中解离11 min。

1.2.2.5 染色

用蒸馏水将桉树根尖冲洗干净，改良的石碳酸品红染色液染色20 m in左右。

1.2.2.6 压片及镜检

将处理好的材料置于载玻片上，滴加染色液，轻轻盖上盖玻片，防止气泡产生，待充分染色后，用铅笔轻轻敲打盖玻片，使材料充分分散均匀，然后使用Olympus BX53的显微镜在目镜10×和物镜100×油镜下显微照相。

1.2.3 试验结果评价

试验中每个处理方法分别取5株柠檬桉根尖用于染色体制片观察的比较，根据分裂时期染色体浓缩的长度、数目以及分散程度作为形态指标。

2 结果和分析

2.1 3种浓度梯度下的秋水仙素不同预处理时间下的染色体形态

利用浓度为0.05%秋水仙素分别处理1、1.5和2 h，由图1观察显示：预处理1 h的桉树根尖染色体分散程度一般，有较多分裂前期的染色体且部分染色体重叠、粘连；处理1 h的根尖染色体粘连、重叠现象严重；预处理2 h的桉树根尖虽然有较多的染色体分裂相，但是染色体浓缩过短，有成团现象。

图2是经过0.1%的秋水仙素预处理1、1.5、2 h后的观察结果。由图2可知，处理1 h的染色体分散性好，但是染色体浓缩过短；处理1.5 h，细胞分裂相较多，染色体长度适中，分散性较好；处理2 h的染色体分裂相不多且分散性差，浓缩成团，完全观察不到染色体的形态特征。

经过0.2%秋水仙素分别处理1、1.5、2 h如图3发现：预处理1 h和1.5 h的均有较多的染色体分裂相，但染色体浓缩过短，且分散性极差，不适合桉树染色体微结构的分析；预处理2 h染色体分裂相较多，且分散性较好。

2.2 8-羟基喹啉不同预处理时间下的染色体形态

图4是经过8-羟基喹啉预处理3、4、5 h的桉树根尖材料，中期分裂相较少，而且染色体不易分散。其中预处理3 h的根尖染色体分散程度较低；处理4 h的根尖染色体细长，容易发生较多的粘连、重叠现象，无法观察到染色体的形态特征；处理5 h的根尖染色体分裂相较少，且不易分散。

2.3 冰水混合物不同预处理时间下的染色体形态

经冰水混合物预处理的根尖结果如图5显示：预处理3、6、10 h的中期分裂相较少，分裂后期的染色体较多，且染色体细长，难以用于计数和染色体核型分析；预处理12 h的根尖，染色体浓缩适中，可以观察到较多的分裂相，但效果不如0.1%浓度秋水仙素处理1.5 h(图2)；处理18 h和24 h的染色体分裂相较少，染色体分散性较好，比较适用于进行染色体计数的研究，但是染色体浓缩过短，染色体之间的大小差异被进一步缩小，无法到观察染色体的形态。

2.4 冰水混合物和 0.1%的秋水仙素不同比例混合处理2 h下的染色体形态

冰水混合物与0.1%秋水仙素分别以2:3、3:2、1:1的体积比混合预处理桉树根尖，结果显示(图6)：以比例为2:3混合预处理的染色体分散性较好，且浓缩程度适中，有较多的分裂相，总体效果较冰水混合物处理12 h好，但差于0.1%浓度秋水仙素处理1.5 h(图2)；以比例为3:2混合预处理的染色体分散程度较差，且分裂中期的染色体较少；以比例为1:1混合预处理的根尖染色体较为细长导致不易分散，且染色体不在同一平面上，拍摄时无法清晰拍摄到每一条染色体，不适合观察染色体的细微形态。

3 结论与讨论

研究植物染色体的核型分析关键是获得较多分裂中期的染色体，而能有效地把处在有丝分裂中的细胞停留在早中期的关键是预处理剂的选择[12]，因此制片成功与否很大程度上取决于预处理的好坏[13]。不同的植物，染色体的大小有所不同，因而对预处理剂的选择也有所差异，鹅掌楸(Liriodendron chinensis)体胚苗根尖染色体制片中采用环己酰胺和 0.2%秋水仙素作为预处理剂能够获得较好的染色体形态[14]。而高山榕(Ficus altissima)在预处理剂2 mmol·L-18-羟基喹啉和0.05%秋水仙素以1:1的体积比混合液效果最好[15]。本试验中柠檬桉在处理剂0.1%秋水仙素下能够取得最好的染色体形态，与王以红等[16]对巨尾桉(E. grandis × E. urophylla)广林9号和尾叶桉(E. urophylla) 4号与处理剂的选择上有着较大的区别，造成以上结论差异的原因可能是试验材料的差异造成的。

预处理时间对材料的染色体形态也有着不可忽视的影响。预处理时间过短，分裂相较少，且容易导致染色体细长，易发生粘连，无法进行染色体计数和研究；而预处理过长，容易导致染色体浓缩过短，不适合观察染色体形态。张健等[17]对木薯(Manihot esculenta)叶片染色体制片技术中4种预处理剂不同预处理时间中均得出 2 h(过短)预处理时间染色体浓缩程度不足、细胞分散差，3 h(适宜)染色体浓缩适中，形态清晰，而4 h(过长)染色体过度浓缩，形态模糊的结论。本试验结果表明：柠檬桉染色体在0.1%秋水仙素预处理1.5 h，细胞分裂相较多，染色体浓缩程度适中，分散性较好。这与王以红等[16]对巨尾桉广林9号和尾叶桉4号的预处理时间也有很大差异，这可能与预处理剂选择和实验材料的不同有关。

另外，在试验中除了要考虑预处理的因素，还要注意在解离后对桉树根尖充分冲洗干净，若材料冲洗不干净，会使根尖不易着色，并且再用铅笔敲打盖玻片时，用力要适当，用力过猛会敲碎盖玻片，用力太小桉树根尖细胞染色体不易分散开，无法进行细微的观察。

本试验仅研究了不同预处理对柠檬桉根尖染色体制片技术的影响，对于柠檬桉染色体的更深领域，还有待于进一步研究。

[1] 杨起简,周禾,孙彦,等.豌豆染色体制片技术的比较研究[J].北京农学院学报,2003,18(3):172‒173,203.

[2] 李懋学,张学方.植物染色体技术[M].哈尔滨:东北林业大学出版社,1991.

[3] 朱徵.植物染色体及染色体技术[M].北京:科学出版社, 1982.

[4] 葛台明.对植物染色体标本去壁低渗制片法的探讨[J].鄂西大学学报(自然科学版),1989(1):98‒101.

[5] 李懋学,陈端阳.关于植物核型分析的标准化问题[J].武汉植物学研究,1985,3(4):287‒289.

[6] 张樟德.桉树人工林的发展与可持续经营[J].林业科学, 2008,44(7):97‒102.

[7] 谢耀坚.中国桉树人工林可持续经营战略初探[J].世界林业研究,2003,16(5):59‒64.

[8] 王豁然.桉树生物学概论[M].北京.科学出版社,2010.

[9] Silvia T M,Maria A.M,Claudete de F. R. Cytogenetic Analysis of seven species of Eucalyptus L'Her. (Myrtaceae) [J]. Caryologia,2000,53(3‒4):205‒212.

[10] 闫素丽,安玉麟,孙瑞芬,等.染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展[J].生物技术通报,2008(4):70‒74.

[11] 邱海燕,王英,高和琼,等.4个巴西橡胶树无性系的核型分析[J].热带作物学报,2010,31(4):509‒513.

[12] 江力榕,陈沁,刘文轩.预处理对辣椒根尖细胞染色体制片的影响[J].上海大学学报(自然科学版),2005,11(4): 427‒430.

[13] 洑香香,施季森,刘晓健.两种预处理方法对杉木核型的影响[J].南京林业大学学报(自然科学版),2001,25(1): 23‒26.

[14] 刘光欣,陈金慧,孙杰,等.杂种鹅掌楸体胚苗根尖染色体核型分析[J].南京林业大学学报(自然科学版),2012,36 (6):13‒16.

[15] 王芳,周兰英.高山榕染色体制片优化及核型分析[J].西北植物学报,2011,31(8):1573‒1576.

[16] 王以红,胡洲鹤,吴幼媚.桉树染色体的染色和制片技术[J].广西林业科学,2004,33(4):177‒179.

[17] 张健,郭军辉,陈雄庭,等.木薯叶片染色体制片技术研究[J].热带作物学报,2012,33(1):20‒23.

Effect of Different Pretreatment M ethods of Corymbia citriodora Chromosome Technology

LIU Si-ru, LIN Yan, LUO Jian-zhong
(China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

Colchicine, 8‒hydroxyquinoline, ice-water mixture, and a mixture of cold water and colchicine (0.1%) were used as pretreatment reagents for Corymbia citriodora root tips for varying durations. The root tips were obtained from new seed germinants. Metaphase chromosomes numbers obtained were highest and chromosome separation was best w ith the pretreatment of 0.1% colchicine for 1.5 h. Relatively few metaphase chromosomes were obtained these showed poor separation for root tips pretreated w ith 2 mmol·L-18-hydroxyquinoline. The pretreatment involving ice-water mixture for 12 h resulted in higher numbers of metaphase chromosomes and better spread of these than the latter treatment, along w ith moderate chromosome condensation. The numbers of metaphase chromosomes appeared higher and good chromosome separation was also obtained when the root tips were treated w ith proportion of ice water and 0.1% colchicine mixed at a ratio of 2:3, and chromosome length was moderate. Based on a comprehensive comparison, the root tip pretreatment methods in order of decreasing effectiveness were: 0.1% colchicine ＞ 2:3 m ixture ＞ice-water ＞ 2 mmol·L-18-hydroxyquinoline. It was also found that the optimal sampling time for taking root-tips was about 11:30 am ‒ 12:30 pm when using the best pretreatment method (i.e. 0.1% colchicine for 1.5 h).

Corymbia citriodora; pretreatment; chromosome

S722.3

A

2015-11-23

国家高技术研究发展计划(863计划)课题(2011AA100202)；林业公益性行业科研专项经费项目(201504204)

收稿日期：刘思汝(1989— )，女，在读硕士研究生，主要从事桉树遗传育种研究. E-mail:liusiruru@126.com

＊通讯作者：罗建中(1969— )，男，研究员，主要从事桉树遗传育种研究. E-mail: luojz69@hotmail.com