HPLC 同时测定甘薯茎叶中叶黄素和β–胡萝卜素

邢鹏，包兢兢，秦玉芝，陆英,2*

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)

类胡萝卜素是一类具有多种生理功能的天然色素，可以预防人心血管疾病、癌症及许多其他慢性疾病[1–2]，其中叶黄素、β–胡萝卜素、玉米黄素、番茄红素等10 余种已被广泛用作抗氧化剂和食品、医药添加剂，在医药、食品、饲料和化妆品工业中发挥着重要作用。

中国是世界上甘薯栽培第一大国，年产量约1.2亿t，占世界总产量的85.9%[3]。甘薯茎叶作为甘薯产业的副产物，除部分食用或作牲畜饲料外，绝大部分被丢弃，造成了资源的极大浪费。近年来，人们逐渐发现甘薯茎叶中含有多种生物活性成分，如黄酮类、绿原酸类等，同时还含有较高的叶黄素和β–胡萝卜素，具有广阔的开发利用前景[4–6]。不同植物品种含有的类胡萝卜素种类、含量均有很大差异。采用HPLC 测定蔬菜果实中多种类胡萝卜素组分时有的提取溶剂不同[7–8]，有的还进行了皂化处理[9–10]，类胡萝卜素总量或单个类胡萝卜素都有降解损失，且甘薯或茎叶中叶黄素和β–胡萝卜素的HPLC 测定多为单一组分，提取方法、流动相组成等也不相同。本研究在对提取条件考察优化的基础上，建立了HPLC 同时测定甘薯茎叶中叶黄素和β–胡萝卜素的方法，操作简便，方法可靠，并对11个品种甘薯茎叶进行了叶黄素和β–胡萝卜素含量测定，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘薯品种为水果薯、水果花叶薯、紫羽1号、紫羽2号、农大紫1号、农大紫2号、浙紫1号、紫薯2号、高淀粉、叶用薯1号、叶用薯2号等，均采自湖南农业大学园艺园林学院蔬菜基地。60℃下烘干、粉碎，备用。

叶黄素和β–胡萝卜素对照品纯度为90%，购于合肥博美生物科技有限公司。乙醇、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇均为分析纯；甲醇、四氢呋喃、乙腈均为色谱纯，购自恒兴化学制造有限公司。

1.2 主要仪器与设备

LC–10AT岛津高效液相色谱仪，配有PDA检测器，色谱柱WondasilTMC18(5 μm，4.6 mm×250 mm，日本岛津公司)；SB3200DT超声波清洗仪(宁波新芝科技股份有限公司)；HH数显恒温水浴锅(江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂)。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

流动相A 为甲醇–水(体积比为95∶5)； 流动相B 为甲醇–乙腈–四氢呋喃(体积比为70∶20∶5)，梯度洗脱：0～10min，100% A；10～30min，100%～70% A，0%～30% B。检测波长为445 nm。流速为1.0mL/min。柱温20℃。

1.3.2 标准曲线的绘制

称取叶黄素14.10mg、β–胡萝卜素15.30mg于10mL 容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1.269mg/mL 和1.377mg/mL 的储备液，测定时逐级稀释至0.253 8mg/mL、0.126 9mg/mL、0.0253 8mg/mL、0.0126 9mg/mL、0.634 5μg/mL、0.126 9μg/mL、0.063 45μg/mL，进样量10 μL,以进样质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 样品溶液制备方法

1) 提取溶剂的确定。称取紫羽1 号茎叶混合原料6 份，每份1.0g，分别加入40mL 甲醇、乙醇、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯，室温下避光浸润12 h，然后超声提取20min，过滤，定容至50mL，过膜进样，测量不同提取溶剂中叶黄素和β–胡萝卜素含量。重复2次，确定最佳提取溶剂。

2) 提取次数的确定。称紫羽1 号茎叶样品5份，按1)中确定的提取溶剂分别提取1、2、3、4、5次，根据提取效果确定提取次数。

3) 提取条件的优化。采用1)中确定的提取溶剂，以料液比、超声温度、超声时间为主要影响因素，进行L9(33)正交试验(表1)，滤渣同法再提取1次，合并滤液，定容至100mL，进样，对提取效果进行正交试验分析，确定最优提取条件。

表1 正交试验因素及水平 Table 1 Orthogonal factors and levels table

1.3.4 方法学考察

1) 精密度试验。取叶黄素与β–胡萝卜素混合标准品连续进样5次，以峰面积计算叶黄素和β–胡萝卜素的RSD。

2) 稳定性试验。称取粉碎的紫羽1 号茎叶混合原料1.0g，加入30mL 甲醇，50℃超声提取40min，过滤，滤渣同法再提取2次，合并滤液，定容至100mL，取20 μL 分别在0、1、2、4、6、8、24 h 进行HPLC 分析，以峰面积计算叶黄素和β–胡萝卜素的RSD。

3) 重现性试验：称取紫羽1 号茎叶混合原料5份，每份1.0g，按稳定性试验方法制备成甲醇提取液, 以峰面积计算叶黄素和β–胡萝卜素的RSD。

4) 回收率试验：称取紫羽1 号茎叶混合原料3份，每份1.0g，加入一定量标准品(叶黄素和β–胡萝卜素分别为0.125 和0.137mg、0.252 和0.275mg、0.377 和0.413mg)，按稳定性试验方法制成供试液，进样，计算加标回收率。

1.3.5 样品的测定

称取粉碎的样品1.0g，加入30mL 甲醇，50℃超声提取40min，过滤，滤渣同法再提取2次，合并滤液，定容至100mL，取20 μL 进行HPLC 分析，根据标准曲线计算样品中叶黄素、β–胡萝卜素含量。

2 结果与分析

2.1 甘薯叶提取物的HPLC 分析

叶黄素和β–胡萝卜素标准品及甘薯叶提取物的HPL 色谱图见图1。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)，叶黄素的回归方程为Y=9.7×106Χ– 1.9×105(R2=0.999 1)，线性范围0.000 635～2.538μg；β–胡萝卜素的回归方程为Y=7.4× 106Χ– 50 189 (R2=0.999 3)，线性范围0.006 885～ 2.538μg。

图1 叶黄素和β–胡萝卜素标准品及甘薯叶提取物的HPLC 色谱图 Fig.1 HPLC chromatogram of lutein , beta-carotene standers and extracts of sweet potato leaves

2.2 试验条件的优化结果

2.2.1 最适提取溶剂

从表2 可知，甲醇、乙醇对叶黄素的提取效果较好，对β–胡萝卜素的提取效果与其他常用提取溶剂的提取效果相近，但采用乙醇为提取溶剂，测定出的叶黄素峰形矮胖，柱效差，因此，选用甲醇作提取溶剂。

表2 不同溶剂提取的叶黄素和β–胡萝卜素的含量 Table 2 Contents of different solvents on the efficiency of lutein and beta-carotene mg/g

2.2.2 最适提取次数

由表3 可见，叶黄素和β–胡萝卜素的提取得率随着提取次数的增加而增加，提取3次后2个目标物的提取量已趋于稳定，因此，确定试验提取次数为3次。

表3 各提取次数下的叶黄素和β–胡萝卜素含量 Table 3 Contents of sequence on effect extract efficiency mg/g

2.2.3 正交试验结果

正交试验的提取效果见表4。从表4 可知，最佳的提取方案为A1B3C1，即固液比1∶30，超声温度50℃，超声时间40min。

表4 正交试验结果 Table 4 Results of orthogonal experimen

2.3 方法学考察结果

精密度试验结果，叶黄素和β–胡萝卜素的峰面积RSD 为0.9%和1.8%，表明该方法具有较高精密度； 6 h 内叶黄素与β–胡萝卜素测定值基本稳定，峰面积RSD 分别为1.2%和1.4%，表明该方法稳定性好；重现性试验中，叶黄素与β–胡萝卜素峰面积RSD 分别为1.3%和1.8%，表明该方法重复性好；叶黄素与β–胡萝卜素的回收率分别为105.8%和101.5%，表明该方法具有较高的准确度。

2.4 甘薯茎叶中叶黄素及β–胡萝卜素含量的测定

由表6 可见，11 份不同品种甘薯茎叶中的叶黄素及β–胡萝卜素含量最高的是成熟叶，其次为新中叶，茎的含量最低，同一部位不同品种间的含量存在差异，成熟叶中的叶黄素含量0.504～1.031mg/g，β–胡萝卜素含量0.188～0.467mg/g；新叶中叶黄素含量0.409～0.617mg/g，β–胡萝卜素含量0.141～ 0.242mg/g；叶柄中叶黄素含量0.094～0.195mg/g，β–胡萝卜素含量0.040～0.082mg/g；茎叶黄素含量0.053～0.103mg/g，β–胡萝卜素含量0.036～0.045mg/g，其中花叶水果薯和紫羽1 号中的含量较高，其成熟叶中的叶黄素含量大于1mg/g，β–胡萝卜素含量大于0.4mg/g。

表5 不同品种甘薯茎叶中的叶黄素和β–胡萝卜素含量 Table 5 Lutein and beta-carotene content in sweet potato leaves and stems mg/g

3 讨论

叶黄素与β–胡萝卜素虽然都属类胡萝卜素，但叶黄素极性较大，可溶于大多数有机溶剂，而β–胡萝卜素极性较小，不溶于水，易溶于氯仿、正已烷等溶剂，因此，测定时的提取溶剂及处理方法均有不同，需要针对不同的提取溶剂进行比较。本研究采用了乙酸乙酯、乙醇、三氯甲烷、甲醇、正己烷、丙酮等作为提取溶剂，发现以甲醇为提取溶剂，对甘薯茎叶中的这2种组分提取效果均较好，经3次提取后可基本提取完全。提取液直接注入HPLC 色谱仪，经梯度洗脱，叶黄素和β–胡萝卜素得到很好分离，方法稳定，重复性好，回收率高，确定该方法准确可信。

近年来，人们逐渐发现甘薯茎叶中含有多种生物活性成分，如黄酮类、绿原酸类以及类胡萝卜素等。本研究结果表明，非叶用品种与叶用品种的甘薯茎叶中叶黄素和β–胡萝卜素含量差异不大，因此，不同品种的甘薯叶作为食用蔬菜均有较高的价值。

甘薯茎叶中叶黄素含量与普通万寿菊叶黄素含量(16～20mg/g)[7]的差距很大，但由于甘薯茎叶产量大，价格低，来源广，安全性高。因此，甘薯茎叶在提取方面仍具有一定优势，作为膳食补充剂开发，具有一定的发展前景。

在鸡日粮中添加5%～8%的银合欢粉(叶黄素含量为0.950mg/g)，蛋黄颜色会加深，添加8%～12%的苜蓿粉(胡萝卜素含量为0.500mg/g)，蛋黄和皮肤的颜色也可以加深[11]，因此，甘薯叶作为饲料添加剂开发也具有较好的发展前景。

[1] Rao A V，Rao L G．Carotenoids and human health [J]. Pharmacological Research，2007(55)：207–216．

[2] Paiva S A，Russell R M．Beta-carotene and other carotenoids as antioxidants[J]．Journal of the American College of Nutrition，1999，18(5)：426–433．

[3] 张彧，吴祎南，陈莉，等．红薯茎叶化学组成的研究进展[J]．食品科学，2006(3)：252–256．

[4] Hiroshi Ishida，Hiroko Suzuno，Noriko Sugiyama，et al. Nutritive evaluation on chemical components of leaves，stalks and stems of sweet potatoes (Ipomoea batatas poir)[J]．Food Chemistry，2000(68)：359–367．

[5] Aurea M Almazan，Fatima Begum，Colette Johnson. Nutritional quality of sweet potatogreens fromgreenhouse plants[J]．Journal of Food Composition and Analyisi，1997，10(3)：246–253．

[6] Harald M．Determination of the carotenoid content in selected vegetables and fruit by HPLC and photodiode array detection[J] ． European Food Research and Technology，1997(38)：88–94．

[7] 叶兆伟，李洵，刘柱明，等．万寿菊中叶黄素的三种提取方法比较[J]．湖北农业科学，2014，4(5)：874–876．

[8] 陶俊，张上隆，徐建国．等．柑橘果实主要类胡萝卜素成分及含量分析[J]．中国农业科学，2003，36(10)：1202–1208．

[9] 石晋．甘薯中类胡萝卜素分析[D]．大连：大连理工大学，2008．

[10] 孙健，彭宏祥，董新红，等．甘薯中β–胡萝卜素 HPLC测定方法分析[J]．食品科技，2009，34(1)：236–238．

[11] 谢仲权，牛树琦．天然植物饲料添加剂生产技术与质量标准[M]．北京：中国农业科学技术出版社，2004：76–77．