超高效液相色谱—串联质谱法同时测定葡萄中8种植物生长调节剂的残留量

2015-07-13王远邢丽杰向晓黎等

安徽农业科学 2015年15期

王远　邢丽杰　向晓黎等

摘要

[目的]建立超高效液相色谱串联质谱法（UPLCMS/MS）同时测定葡萄中8种植物生长调节剂残留量的方法。[方法]将供试葡萄样品经乙腈提取，分散固相萃取，采用BEH C18色谱柱分离，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子化，正负离子分段扫描和多反应监测模式（MRM）检测，外标法定量。[结果]试验得出，缩节胺、矮壮素、赤霉素在2.5 ～500 ng/ml，6苄氨基嘌呤、对氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑、2，4二氯苯氧乙酸在1～200 ng/ml范围内线性关系良好，相关系数均大于0.990。8种植物生长调节剂的方法检出限为0.2～0.5 μg/kg，方法定量限为0.5～1.5 μg/kg，样品添加回收试验的平均回收率为73.5%～102.2%，相对标准偏差为2.9%～9.7%（n=7）。[结论]该方法简单、灵敏度高、分析时间短，适用于葡萄中8植物生长调节剂的测定。

关键词超高效液相色谱-串联质谱；植物生长调节剂；残留；葡萄

中图分类号 S481+.8；O657.63 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2015）15-247-05

Determination of 8 Plant Growth Regulator Residues in Grape by UPLCMS/MS

WANG Yuan，XING Lijie，XIANG Xiaoli et al

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract [Objective] A method was established for determining 8 plant growth regulator residues in grapes by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）.[Method] Samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up dispersivesolid phase extraction.The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and water.The samples were detected under positive and negative multiple reactions monitoring（MRM） mode through polarity switching between time segments.[Result] The linearities of mepiquat chloride，chlormequat chloride and gibberellic acid were in the concentration range of 2.5-500 ng/ml， 6benzylaminopurine，4chlorophenoxyaceticacid，forchlorfenuron，paclobutrazol and 2，4dichlorophenoxyacetic were in the concentration range of 1-200 ng/ml，with the correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） and the limits of quantitation（LOQ） of the method were 0.2-0.5 μg/kg and 0.5-1.5 μg/kg.The average spiked recovery rates were in the range of 73.5%-102.2%.The relative standard deviation（RSD，n=7） was 2.9%-9.7%.[Conclusion] The method proved to be simple，sensitive，rapid and suitable for the determination of 8 plant growth regulator residues in grapes.

Key words Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）； Plant growth regulator； Residue； Grape

植物生長调节剂（Plant growth regulator，PGRs）是一种能促进植物生长、提高作物产品质量和品质的一类植物激素[1]。植物生长调节剂可分为植物生长促进剂、延缓剂和抑制剂3大类。目前，生产上广泛使用的类别有生长素类（吲哚3乙酸、吲哚3丁酸、α萘乙酸、2，4二氯苯氧乙酸、对氯苯氧乙酸和对氟苯氧乙酸）、细胞分裂素类（异戊烯腺嘌呤、氯吡脲和6苄氨基嘌呤）和赤霉素类等[2]。近年来，由于植物生长调节剂使用不当引起的食品安全问题逐渐增多，植物生长调节剂在农作物中的残留可通过食物链进入人体，轻者造成腹泻等疾病，重者使人体免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌、致突变等严重后果[3]。

美国、欧盟、澳大利亚、加拿大和日本相继对常用植物生长调节剂的一种或几种制定了最高残留限量（MRLs）。我国对于植物生长调节剂的规定相对较少，国家标准GB 2763中涉及到常用植物生长调节剂有2，4二氯苯氧乙酸、矮壮素、多效唑和氯吡脲，但是对葡萄中残留限量作规定只有2，4二氯苯氧乙酸和氯吡脲，最高残留限量均为005 mg/kg[4]。

目前对于常用植物生长调节剂残留的研究主要包括：高效液相色谱法[5-6]、气质联用法[7-8]和液质联用法[9-14]。液相色谱法由于抗干扰能力差，存在一定的假阳性；气质联用前处理较为复杂，检测时间较长；液质联用法对于物质的分析从结构上进行确认，大大降低了假阳性，同时前处理方法简单、时间短，适用于多组分快速检测。新疆是我国主要的葡萄产区，但是在葡萄中植物生长调节剂限量制定方面还不完善，因此，建立葡萄中常用植物生长调节剂残留量的检测方法尤为重要。该研究主要集中在葡萄中常使用的8种植物生长调节剂，采用超高效液相色谱-串联质谱技术，正负离子同时切换测定葡萄中8种植物生长调节剂的残留量，该方法操作简便、灵敏度高，可满足同时对葡萄中多种植物生长调节剂残留进行定性及定量分析的要求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂。

乙腈（HPLC级），德国MERCK公司；甲醇（HPLC级），德国CNW公司；N丙基乙二胺吸附剂（PSA），上海安谱科学仪器有限公司；无水硫酸镁、氯化钠、乙酸乙酯，均为分析纯。所用水为超纯水。8种植物生长调节剂标准品：赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6苄氨基嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、对氯苯氧乙酸（4chlorophenoxyaceticacid 4CPA）、氯吡脲（forchlorfenuron）、多效唑（paclobutrazol）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4dichlorophenoxyacetic）、縮节胺（mepiquat chloride）、矮壮素（chlormequat chloride），纯度均大于96%，德国Dr.Ehrenstorfer。

1.1.2 主要仪器与设备。

Waters Xevo TQMS 液质联用仪，美国Waters公司；匀浆机，德国IKA公司；氮吹仪，美国Organomation公司；高速冷冻离心机，德国Sigma公司；超声仪KQ600DE，江苏昆山市超声仪器公司；超纯水仪，成都超纯科技有限公司。

1.2 仪器参数

1.2.1 色谱条件。

BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，粒径1.7 μm），柱温30 ℃，进样体积5 μl，流动相为水-乙腈（梯度洗脱），流速为0.4 ml/min。

1.2.2 质谱条件。

电喷雾离子源，正离子/负离子电离（ESI+/ESI），脱溶剂气800 L/h，干燥气温度400 ℃，锥孔气50 L/h，离子源温度150 ℃，在分析过程中，以离子对（1母离子和2个子离子）信息比较进行定性分析；以母离子和响应值最高的子离子进行定量分析。8种植物生长调节剂在多反应监测模式下质谱参数见表1。

1.3 样品处理

称取5.0 g（精确至0.01 g）葡萄样品于50 ml离心管中，加入20 ml乙腈，匀浆1 min，超声提取5 min，再加入2 g氯化钠，涡旋后离心，取乙腈层，待净化。将400 mg无水硫酸镁和100 mg PSA加入上述提取液中，涡旋1 min，离心后准确移取10 ml上清液至试管中，45 ℃下氮吹至近干，加入1 ml乙腈水溶液（乙腈∶水=2∶8）溶解，涡旋混匀，经022 μm滤膜后，在UPLCMS/MS上测定。

1.4 标准曲线及检出限

8种植物生长调节剂标准溶液的配制：分别精密称取8种植物生长调节剂标准品适量，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释成浓度为1.00 mg/ml的标准储备液，量取标准储备液适量，再逐步稀释成工作液。在选定的色谱条件和质谱条件下测定，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，分别得到8种植物生长调节剂的线性方程和相关系数。计算3倍信噪时所对应的样品浓度，作为方法的检出限，10倍信噪时所对应的样品浓度，作为方法的定量限。

1.5 方法回收率及精密度试验

采用对阴性样品进行加标回收试验来考察方法的准确度和精密度，即对本底不含植物生长调节剂的阴性葡萄样品，分别添加3个水平的8种植物生长调节剂标准溶液，按照“1.3”项下进行样品前处理，在“1.2.1”项下的色谱条件和“1.2.2”项下的质谱条件下测定，计算样品加标回收率。每个添加水平连续重复进样7 次，测得各组分的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

比较了乙腈、甲醇、乙酸乙酯作为提取溶剂对葡萄中8种植物生长调节剂的提取效率，结果发现，乙腈和甲醇对8种植物生长调节剂的提取效率要高于乙酸乙酯，由于样品本身中含有大量水分，甲醇作为提取剂，在浓缩之前要用大量除水剂除去样品中的水分，而乙腈作为提取剂只需要在提取后加入少量的氯化钠，就可以使乙腈和水相分离，因此选乙腈经作为提取溶剂。

2.2 色谱条件的选择

首先比较了甲醇和乙腈分别作为有机流动相，结果表明，甲醇和乙腈的洗脱能力都比较良好，使用乙腈时，灵敏度要高于甲醇，这是由于甲醇会使离子化受到不同程度的抑制。其次比较了水相中加甲酸和不加甲酸，结果表明，不加甲酸时，灵敏度要明显高于加甲酸，是由于在正负离子同时检测时，加入甲酸会影响负离子模式的离子化效率。最后比较了定容液的组成对各个组分的影响，由于甲酸对负离子的离子化有抑制的作用，所以选择乙腈水体系作为定容液，同时比较了乙腈水体系中乙腈和水的组成比例（乙腈和水体积比分别为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）对各个组分的影响，结果发现当乙腈和水体积比为2∶8时，各组分达到最大响应值。故选择乙腈和水体积比为2∶8作为最后上机定容溶液。

2.3 线性相关性

采用外标法定量，在上述仪器条件下进行测定，以MS/MS定量离子色谱峰面积（y）对浓度（x）绘制标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数。8种植物生长调节剂在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比计算分别得到8种植物生长调节剂的检出限和定量限，结果见表2。8种植物生长调节剂的检出限为0.2～0.5 μg/kg，定量限为0.5～1.5 μg/kg。8种生长调节剂标准品总离子流见图1，加标总离子流见图2。

2.4 方法的准确度和精密度

按照“1.5”方法进行回收率和精密度试验（表3），计算加标回收率和相对标准偏差。由表3中的回收率和RSD数据可以看出，样品在3个添加水平下8种植物生长调节剂的回收率处于73.5%～102.2%，相对标准偏差2.9%～9.7%。上述结果表明，运用该方法得到的数据是准确可靠的。结合前面所述的方法检出限低的特点可知，该方法能够从根本上消除检测结果出现假阴性的可能性。

2.5 实际样品的测定利用该方法对新疆维吾尔自治区3个批次20个葡萄样品进行了检测，其中葡萄中检出氯吡脲、2，4二氯苯氧乙酸、多效唑、矮壮素，含量在2～10 μg/kg范围内，其他均未检出，方法适用性良好。8种生长调节剂实际样品总离子流图见图3。

3 结论

该试验通过对提取条件和质谱条件的优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定葡萄中8种植物生长调节剂残留量的方法。该方法前处理简单、灵敏度高，线性关系、准确度和精密度良好，能满足葡萄中8种植物生长调节剂残留限量要求，方法适应性良好。

参考文献

[1]

GIANNAKOULA A E，LLIAS I F，MAKSIMOVIC J J D，et al.The effects of plant growth regulators on growth，yield，and phenolic profile of lentil plants[J].J Food Compos Anal，2012，28：46-53.

[2] 馬国瑞，侯勇.常用植物生长调节剂安全施用指南[M].北京：中国农业出版社，2008.

[3] 吴凤琪，靳保辉，陈波，等.水果中8种外源性植物生长调节剂的液相色谱-串联质谱测定[J].中国农学通报，2010，26（15）：115-119.

[4] 国家卫生和计划生育委员会，农业部.GB 2763-2014 食品中农药最大残留限量[S].北京：中国标准出版社，2014.

[5] 周艳明，汤嫒，牛森.高效液相色谱法检测草莓中赤霉素残留量的研究[J].食品工业科技，2009，30（1）：311-321.

[6] 张慧荣，周围，王波，等.UPLC法测定苹果中4种新型植物生长调节剂农药残留[J].分析实验室，2014，33（9）：1097-1100.

[7] 宋莹，张耀海，黄霞，等.气相色谱-串联质谱法快速检测水果中的多效唑残留[J].分析化学，2011，39（8）：1270-1273.

[8] 徐宜宏，蒋施，付海滨，等.气相色谱-质谱法同时测定树莓中6种农药的残留[J].农药，2014，53（2）：113-115.

[9] 曹慧，陈小珍，祝颖，等.QuChERS/超高效液相色谱-串联质谱技术同时测定食品中13种植物生长调节剂残留[J].化学试剂，2013，32（11）：1005-1009.

[10] 牟艳莉，郭德华，丁卓平.高效液相色谱-串联质谱法检测瓜果中的4种植物生长调节剂的残留量[J].色谱， 2013，31（10）：1016-1020.

[11] 黄何何，张缙，徐敦明，等.QuChERS -高效液相色谱-串联质谱法同时测定水果中21种植物生长调节剂的残留量[J].色谱，2014，32（7）：707-716.

[12] 张慧，吴颖，路勇，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑残的残留量[J].食品工业科技，2010，31（10）：383-385.

[13] 王静静，鹿毅，杨涛，等.HPLCMS/MS法同时测定果蔬中6种植物生长抑制剂残留[J].分析测试学报，2011，30（2）：128-134.