七氟烷对卵白蛋白致敏的高反应气道平滑肌cAMP的影响

周 静， 邱 鹏， 邢 准， 董有静

(中国医科大学附属盛京医院麻醉科，辽宁 沈阳 110004)



·基础研究·

七氟烷对卵白蛋白致敏的高反应气道平滑肌cAMP的影响

周 静， 邱 鹏， 邢 准， 董有静

(中国医科大学附属盛京医院麻醉科，辽宁 沈阳 110004)

目的 观察七氟烷对卵白蛋白致敏的豚鼠的高反应气道平滑肌细胞内环磷酸腺苷(cAMP)的影响。方法 40只雄性豚鼠随机分为5组: 正常组、致敏组、致敏对照组、致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷组，每组8只。应用卵白蛋白和测量肺阻力变化曲线建立并评价豚鼠的致敏气道模型。检测致敏豚鼠气道平滑肌细胞cAMP的表达，评价不同浓度七氟烷对高反应致敏气道的扩张作用。结果 与正常组相比，致敏组能显著升高豚鼠的肺阻力变化曲线；与致敏对照组相比，致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷组的气道平滑肌细胞内cAMP的表达明显增高。结论 七氟烷能够增加卵白蛋致敏的豚鼠的气道平滑肌细胞内cAMP的表达，提示七氟烷可以通过提高高反应致敏气道平滑肌cAMP的表达发挥扩张作用。

七氟烷； 环磷酸腺苷； 气道平滑肌； 高反应气道； 豚鼠

气道高反应性是指气道的过度反应状态，通常是气道受到变应原或其他刺激后，由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子的参与、气道上皮和上皮内神经的损害等导致，表现出敏感而过强的支气管平滑肌收缩反应，引起气道狭窄，气道阻力增加和相应的肺顺应性下降，从而引发咳嗽、胸闷、呼吸困难和喘息等症状，是围手术期常见的病理生理反应[1]。近年来，由于气道炎症、病毒感染、SO2、冷空气、干燥空气等理化刺激，使得具有气道高反应性的患者，在全球范围内迅速增长，随之而来的是呼吸道疾病(如支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等)的高发病率。目前，针对高反应气道患者的围术期管理已经成为的临床麻醉领域关注的焦点问题，其有效措施主要着眼于使用预防气道收缩和应用具有潜在气管扩张效果的药物。而在众多麻醉药物的选择中，吸入性麻醉药通常被视为一线药物用于气道高反应患者的麻醉维持[2]。

七氟烷是新兴的一种高效含氟吸入麻醉药。对热和强酸稳定，无刺激性气味，最小肺泡有效浓度(MAC)在纯氧中为1.7%，苏醒迅速，麻醉深度易调节。在临床全身吸入麻醉实施中，七氟烷的优势在于诱导和苏醒较现有的强效麻醉药快，有良好的作用。副作用方面，七氟烷对心血管影响比异氟烷小，心律失常少见，与肾上腺素合用无妨；随麻醉加深呼吸抑制加重，但较氟烷轻；对脑血流量、颅内压影响与异氟烷相似，未见明显的肝损害。故七氟烷具有广阔的临床应用前景，特别是对小儿和老年患者。然而，针对具有高反应气道的患者，七氟烷是否具有保护作用，其作用效果和作用机制目前尚不明确，仍存在争议[3]。本课题组既往研究显示，七氟烷可以通过降低致敏气道的肺阻力和气道平滑肌的张力发挥扩张作用，为进一步深入明确其作用机制，本研究拟用卵白蛋白致敏的豚鼠模型，测量七氟烷干预的卵白蛋白致敏的离体气道平滑肌环磷酸腺苷(cAMP)的表达，揭示七氟烷对致敏高反应气道的作用效应。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

5周龄雄性豚鼠，体质量300～350g，札幌医科大学动物部提供(伦理编号08-023)。实验动物随机分为: 正常组、致敏组、致敏对照组、致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷组，每组8只。

1.2 主要试剂与仪器

七氟烷、卵白蛋白、乙酰胆碱等试剂均购于日本Sigma公司。气道、食道测压装置(DP-45)购于美国Validyne Engineering公司，压力转换器(Plumos-Ⅱ)购于日本Medical Interface Project Station公司，cAMP试剂盒购于美国Biovision公司。

1.3 方法

1.3.1 致敏气道模型建立 根据McCaig等[4]致敏气道模型的经典制备方法，制备致敏豚鼠。方法简述如下: 向豚鼠腹腔内注射1mg卵白蛋白，10d后雾化吸入卵白蛋白，每次剂量1mg，持续10min，每日1次，连续3d。正常组的豚鼠，采用生理盐水代替卵白蛋白进行腹腔注射和雾化吸入。

1.3.2 肺阻力的测定 雾化吸入结束后的次日，腹腔内注射乌拉坦1.5g/kg。行气管插管，容量控制呼吸，呼吸频率为32 次/min，潮气量为(6～8)ml/kg，根据呼吸末CO2(维持在40mmHg左右，1mmHg=0.133kPa)，调整潮气量。开放右中心静脉，置管，连续给予罗库溴铵2mg/(kg·h),以消除自主呼吸。经口腔置测压管到食道中下1/3。应用气道、食道测压装置和压力转换器，连续测量瞬时肺阻力。

1.3.3 致敏气道模型评价 正常组与致敏组豚鼠中，肺阻力值达到稳态后，静脉连续给予乙酰胆碱，剂量由1～6μg/kg，间隔时间为5min，每次剂量增加1μg/kg。根据肺阻力对不同剂量乙酰胆碱的峰反应值，得到肺阻力的剂量反应曲线，评价致敏气道模型。

1.3.4 气道平滑肌细胞内cAMP表达的测定 致敏对照组、致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷3组豚鼠中，肺阻力值达到稳态后，分别吸入0、2%(豚鼠的1个最低肺泡有效浓度)、4%的七氟烷20min。放血法处死豚鼠后，取气管环连接处的整条气道平滑肌,置于生理盐缓冲液(136.9mmol/L NaCl, 5.4mmol/L KCl, 1.5mmol/L CaCl2, 1.0mmol/L MgCl2, 23.9mmol/L NaHCO3,5.5mmol/L葡萄糖, 37℃)，清除结缔和脂肪组织后，迅速将标本置于液氮并于-80℃冰箱保存待用。根据cAMP试剂盒的操作步骤测量气道平滑肌标本的cAMP的浓度。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 致敏气道模型的肺阻力变化

对正常组与致敏组豚鼠给予不同剂量乙酰胆碱后，与正常组相比，致敏组豚鼠的肺阻力变化曲线显著抬高。其中，当乙酰胆碱剂量为3～6μg/kg时，两组的峰值差异有统计学意义(P<0.05)。当乙酰胆碱剂量分别为0、6μg/kg时，致敏组的肺阻力峰反应值比正常组分别高18%、40%。

图1 正常组和致敏组对不同剂量乙酰胆碱的肺阻力峰值的影响Fig.1 The peak response of lung resistance to different doses of acetylcholine in normaland sensitized groups与正常组相比，*P<0.05

2.2 七氟烷应用后气道平滑肌细胞内cAMP表达的变化

应用不同剂量七氟烷后，与致敏对照组[(0.52±0.15)pmol/μl]相比，致敏2%七氟烷组[(1.12±0.32)pmol/μl]和致敏4%七氟烷组[(1.32±0.25)pmol/μl]的气道平滑肌细胞内的cAMP值明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷组间峰值差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 致敏对照组、致敏2%七氟烷组和致敏4%七氟烷组的气道平滑肌细胞内cAMP的表达Fig.2 Intracellular cAMP levels of airway smooth muscle in sensitized control, sensitized 2% sevoflurane and sensitized 4% sevoflurane groups与致敏对照组相比，*P<0.05

3 讨 论

吸入麻醉药的气道作用有很强的临床实用价值，可直接作用于气道平滑肌，在临床使用浓度范围内发挥直接舒张气道的效应，有效降低气道阻力，减轻气道高反应。不但用于高反应气道患者的围术期管理，而且推荐用于哮喘患者的麻醉实施与治疗，对于传统方法治疗无效的哮喘持续状态的患者，吸入麻醉药往往会取得良好的临床效果。其舒张气管平滑肌的作用主要与抑制钙通道、降低钙离子的浓度、抑制气管平滑肌细胞对钙的敏感性及促进气管平滑肌细胞膜超极化等有关。近年来，对吸入麻醉药舒张气道平滑肌的作用及机制又有了新的进展，包括: (1) 抑制储存钙通道的开放，导致细胞内钙离子浓度降低而引起气管平滑肌舒张[6]；(2) 增加气道平滑肌蛋白磷酸激酶的活性，促进肌球蛋白轻链脱磷酸化，在细胞内钙离子浓度不变的情况下舒张气管平滑肌，降低气管阻力[7]；(3) 抑制Gαq/11蛋白由失活型向激活型的转变，和气管平滑肌收缩有关的G蛋白亚型是Gαq/11，且也是吸入麻醉药的作用位点，抑制此位点能抑制平滑肌收缩，从而降低气道阻力[8]。

七氟烷是现阶段临床广泛应用的吸入麻醉药之一，其舒张气道平滑肌的作用优于异氟烷、氟烷。但是，七氟烷对于致敏高反应气道的作用仍存在争议，虽然有临床报道七氟烷可以增加轻、中度哮喘儿童的肺阻力[9]，但更多的研究[10-13]证实七氟烷具有气道扩张作用。本研究结果表明，在致敏气道中，七氟烷可以提高气管平滑肌细胞内cAMP的水平。Iwasaki等[14]曾报道七氟烷可以通过提高高反应气道平滑肌细胞内cAMP的表达，促使气道平滑肌舒张。cAMP是细胞内重要的第二信使，可以调节细胞的各种功能，进而引起相关的病理生理改变。它能够激活蛋白激酶A(PKA)，促进PKA磷酸化相应的功能蛋白，使肌肉收缩受阻,进而促进平滑肌松弛；同时，cAMP还可以促进细胞内钙离子外流和内质网对钙离子的摄取，降低细胞内钙离子的浓度，引起平滑肌舒张[15]。因此，本研究结果提示的七氟烷可以通过提高致敏气道平滑肌细胞cAMP表达，发挥其气道扩张的作用，是与既往研究结果相一致的；它们共同揭示了高表达的cAMP是七氟烷降低致敏气道肺阻力的机制之一，而与其相关的更多、更深入的研究吸入麻醉药七氟烷对卵白蛋白致敏的高反应气道的扩张作用机制有待于我们继续探讨。

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Effect of sevflurane on cAMP levels in smooth muscle cells of ovalbumin-sensitized hyperresponsiveness airway in guinea pigs

ZHOUJing,QIUPeng，XINGZhun,DONGYou-jing

(Dept. of Anesthesiology, Shengjing Hospital, China Medical Uneversity, Shenyang 110004, Liaoning Province, China)

Objective To investigate the effects of sevoflurane on cAMP levels in smooth muscle cells of ovalbumin-sensitized hyperresponsiveness airway in guinea pigs. Methods Forty male guinea pigs were randomly divided into 5 groups: normal group, sensitized group, sensitized control group, sensitized 2% sevoflurane group and sensitized 4% sevoflurane group(n=8 in each group). The lung resisitance was recorded and the dose-response curves for acetylcholine of lung resistance were used to evaluate the sensitized airway model. The intracellular cyclic adenosine monophosphate(cAMP) levels in airway smooth muscle cells were measured to evaluate the brochodilator effect of sevoflurane. Results The dose-response curves for acetylcholine of lung resistance were elevated significantly in the sensitized group compared to normal group. The intracellular cAMP levels in the airway smooth muscle cells were higher in sensitized 2% sevoflurane and sensitized 4% sevoflurane groups than those in sensitized control group. Conclusion Sevoflurane can increase the intracellular cAMP levels in airway smooth muscle cells of sensitized guinea pigs, which suggests that sevoflurane has a brochodilator effect in sensitized airways.

sevoflurane; cAMP; airway smooth muscle; hyperresponsiveness airway; guinea pigs

10.16118/j.1008-0392.2015.04.005

2015-02-01

辽宁省自然科学基金(2014021023)

周 静(1980—)，女，讲师，博士.E-mail： zhoujing200427565@163.com

R 971

A

1008-0392(2015)04-0025-04