针康法对脑缺血大鼠脑组织VEGF、LN 表达的影响*

朱路文，唐 强，李 季，赵 彬，陈慧杰

(黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001)

缺血性卒中(ischemic stroke)约占全部脑卒中的70%，其发病率、致残率和致死率高。脑缺血后常伴有运动障碍、感觉障碍、认知功能障碍等，严重影响了患者的日常生活。针康法是脑卒中康复的新策略，是头穴丛刺与现代康复技术的有机结合，具有针刺康复同步、动态治疗的特点［1］。前期研究表明，针康法能减轻缺血脑组织水肿，增加缺血周边区突触数目，升高脑缺血区皮层GAP-43 表达，降低Nogo-A 表达［2］。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种促血管新生因子，对局灶性脑缺血神经功能缺损改善作用明显。层粘连蛋白(Laminin，LN)变化可直接导致血脑屏障通透性的改变［3］，在脑缺血中有维持血管完整性、防止脑水肿及继发性神经元损伤的作用［4］。本研究观察脑缺血后及针康法干预后脑组织VEGF 及LN 的变化，探讨针康法治疗缺血性脑卒中的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级Sprague- Dawley(SD)雄性大鼠，体重(250 ±30)g，购自黑龙江中医药大学动物实验中心，动物质量合格证编号为SYXK(黑)2010007。饲养条件:SPF 级实验中心，大鼠可自由进食、饮水，室温控制在20℃～25℃，湿度保持50% ～60%，明暗光照12 h昼夜循环。

随机将90 只大鼠分成模型组、假手术组、针刺组、康复组及针康组5 组，每组按术后3 天、7 天、14 天时间点再分为3 个亚组，每个亚组6 只。实验处置符合小动物伦理标准。

1.2 主要仪器及试剂

RM2265 型切片(德国Leica);HI1210 型摊片机(德国Leica);DHG-9030A 型电热鼓风干燥箱(中国上海);兔抗大鼠VEGF 多克隆抗体(武汉博士德);兔抗大鼠LN 多克隆抗体(武汉博士德)。

1.3 模型制备

采用阻闭大鼠大脑中动脉(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)诱导永久性局灶性脑缺血。术前12 h禁食不禁水。10%水合氯醛麻醉，术中动物保持自主呼吸，恒温加热板保持大鼠体温恒定(37. 0 ±0.5℃)。颈部常规消毒，颈部正中切口，暴露大鼠颈总动脉、颈外动脉以及颈内动脉，将颈总及颈外动脉结扎，在颈总动脉分叉部的下方使用眼科剪剪一小切口，将尼龙单纤丝线(Japan)一末端烤成约2.6 cm 的圆头插入颈内动脉17 ～18 mm，完全阻断大脑中动脉的血流。假手术组大鼠手术方法同模型组，但线栓仅从颈总动脉插入约10 mm，不能阻断大脑中动脉血流供应。术后6 h 采用改良的Bederson 标准［5］进行神经功能评分，1 ～3 分的pMCAO 大鼠纳入本实验。

1.4 干预方法

模型组:造模后回笼饲养，不予任何治疗，只予以同等条件抓取。

假手术组:造模后回笼饲养，不予任何治疗，只予以同等条件抓取。

针刺组:造模后24 h，采用头穴丛刺针法治疗。参照前期实验研究，采用1.0 寸针灸针，取百会穴及百会左、右侧各旁开2 mm 处针刺，快速捻转1 min 后留针2 h，每日1 次。

康复组:造模后24 h，采用跑台训练模拟临床康复治疗(在造模前均经过适应性跑台训练3 天，每天10 min，速度为15 m/min)。参照前期预实验形成的方案:时间:30 min/天;速度:1 ～3 天8 m/min，4 ～7 天12 m/min，7 天后15 m/min;坡度:0°;1 次/天。

针康组:造模后24 h，采用针康法治疗。针康法参照［6］，头穴丛刺留针期间进行跑台训练，针刺方案同针刺组、跑台方案同康复组，每日1 次。

1.5 取材及指标检测方法

术后3 天、7 天、14 天，大鼠以10%水合氯醛麻醉，0.9%生理盐水200 ml、4%多聚甲醛200 ml 灌注。分离缺血侧脑组织，4%多聚甲醛PBS 溶液中固定48 h后，取视交叉和其后4 mm 处两点，切取脑冠状薄片，厚度约4 mm，常规石蜡包埋，切片厚度为4 ～6 μm，免疫组织化学染色。

采用免疫组化PV 二步法检测血管内皮生长因子(VEGF)、层粘连蛋白(LN)在缺血半暗区皮层的表达，具体方法参照试剂盒。每只大鼠取相同部位连续切片5 张，显微镜在10 ×40 倍下对视野中VEGF、LN阳性细胞进行计数，取平均值进行统计分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠缺血半暗区皮层血管内皮生长因子(VEGF)的表达

假手术组可见少量的血管内皮生长因子(VEGF)表达，阳性细胞胞体小，突起细。脑缺血后，VEGF 阳性表达增多，随着缺血时间延长，先增加后降低，与假手术组比较差异显著(P ＜0.05)。采用针康法、针刺、康复训练干预后，缺血脑组织VEGF 阳性细胞数增加，说明针刺、康复训练、针康法均能促进脑缺血后血管内皮细胞增殖。术后7 天、14 天，与模型组相比，康复组、针刺组与针康组VEGF 阳性表达增强(P ＜0.05);与康复组、针刺组比较，针康组VEGF 阳性细胞数增多(P ＜0.05)。以上结果表明，针康法能启动脑缺血后内源机制，促进VEGF 阳性表达，优于单纯康复和针刺。见图1。

图1 VEGF 阳性细胞统计图

2.2 各组大鼠缺血半暗区皮层层粘连蛋白(LN)的表达

假手术组LN 阳性表达较强，镜下可见大量LN 阳性细胞，呈裂隙状或条索状。模型组LN 阳性表达较低，与假手术组比较，差异显著(P ＜0.05)，表明脑缺血后血脑屏障受损，LN 的表达下降。随着缺血时间延长，LN 的表达逐渐增加。术后7 天、14 天，康复组、针刺组与针康组LN 阳性表达较模型组增强(P ＜0.05);与康复组、针刺组比较，针康组LN 阳性细胞数明显增多(P ＜0.05)。以上结果表明，针刺、康复训练、针康法干预均能促进LN 阳性表达，改善血脑屏障的通透性，针康法的治疗优势更明显。见图2。

图2 LN 阳性细胞统计图

3 讨论

针康法是头穴丛刺与现代康复技术的有机结合，具有“针康同步、动态治疗、整体康复”的特点。在针康法的核心内容中，头穴丛刺的效应能够透过颅骨，刺激大脑皮层，直达责任病灶;康复训练作用于四肢，通过多次重复的动作，非侵入性刺激中枢系统，提高脑结构、功能的可塑性，两者双向调节、同时作用，促进受损脑功能的恢复。

VEGF 又名血管通透性因子，是一种特异性地作用于内皮细胞表面受体的血管生成因子，具有维持血管通透性、诱导血管发生的作用。脑缺血、缺氧可诱导内源性VEGF 表达，促进血管内皮细胞分化、增殖，缩小脑梗死体积;血管表皮生长因子受体(VEGF-R)通过多种信号途径介导微血管及神经再生，促进内源性神经干细胞增殖、迁移和分化，发挥脑保护作用［7］。本实验中，各时间点模型组VEGF 阳性细胞数较假手术组增加，差异显著(P ＜0.05)，说明脑缺血启动内源性机制促进VEGF 阳性表达，修复损伤的血管内皮细胞。各时间点，针刺组、康复组及针康组VEGF 阳性细胞表达均明显高于模型组，说明3 种干预方法均能激活神经血管单元中的血管内皮保护因子;陈鹏典等［8］证明了督脉电针联合人脐血MSCs 移植具有协同效应，可上调缺血区半暗带VEGF 表达，促进血管新生，与本研究结果相一致。术后7 天、14 天两个时间点，针康组VEGF 阳性表达明显高于针刺组及康复组(P ＜0.05)，这表明针康法可上调VEGF 阳性表达，在促进脑缺血后微血管修复上优于单纯针刺及康复。

血脑屏障是脑组织最重要的防御结构之一，其通透性发生改变将影响神经元的存活。LN 是一种大型的糖蛋白，是胚胎发育中出现最早的细胞外基质成分［3］，与Ⅳ型胶原一起构成基膜，参与组成血脑屏障，缺血后它的一系列变化将直接改变血脑屏障通透性。细胞表面的特异性受体与层粘连蛋白结合，细胞与基底膜结合成为一个紧密体，起到保护、过滤的作用，并决定细胞的极性，影响细胞的代谢、存活、迁移、增殖和分化［4］。本研究结果发现，脑缺血后LN 蛋白的表达增加，恢复血脑屏障通透性，同时与神经胶质细胞共同促进神经元的生长、分化以及轴突的生长。针康法、针刺、康复干预后LN 的表达较模型组明显上调，说明这3 种方法都能通过恢复血脑屏障通透性发挥脑保护作用，但针康法上调LN 的表达更加明显，在保护血脑屏障上的优势更突出。

综上，本实验结果表明针康法能促进脑缺血区半暗区VEGF、LN 的表达，从而促进脑缺血后微血管的再生，改善血脑屏障的通透性。

［1］ 唐强.头穴丛刺与康复治疗的有机结合［J］. 中国康复理论与实践，2011，17(4):301-303

［2］ 唐强，朱路文，邢艳丽，等.针康法对脑缺血大鼠运动功能及GAP-43、Nogo-A 表达的影响［J］.针灸临床杂志，2015，31(1):54-7

［3］ 胡晓松，周东，唐瑜，等. 层粘连蛋白及基质金属蛋白酶-9 在大鼠局灶性脑缺血梗死区周围的表达及意义［J］. 华西医学，2013，28(5):651-654

［4］ LEE H，PARK J- W，KIM S- P，et al. Doxycycline inhibits matrix metalloproteinase- 9 and laminin degradation after transient global cerebral ischemia［J］.Neurobiol Dis，2009，34(2):189-198

［5］ BEDERSON JB，PITTS LH，TSUJI M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-6

［6］ 唐强，刘宏光，王艳，等.针康法对局灶性脑缺血大鼠前肢运动功能及缺血区突触素和生长相关蛋白-43 表达的影响［J］.中国康复理论与实践，2011，17(10):973-6

［7］ 姚瑞芹，李林.血管内皮细胞生长因子在缺血性脑损伤中血管新生，神经发生和神经保护的作用［J］.中国康复理论与实践，2007，13(3):208-11

［8］ 陈鹏典，杨卓欣，于海波，等. 督脉电针联合人脐血MSCs 移植对脑缺血大鼠VEGF 蛋白表达的影响［J］.中华中医药学刊，2014，32(6):1261-3