电针配合穴位注射骨瓜提取物治疗日本大耳白兔类风湿关节炎的实验研究

李翠芳，赵凌艳，肖 丽

(十堰市太和医院 附属湖北医药学院，湖北 十堰442000)

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一类原因不明好发于四肢关节、心脏等器官的自身免疫性疾病，临床病理改变以四肢关节滑膜慢性炎症为主，常累及关节软骨滑膜及骨质［1］。其病因主要为软骨的破坏与变性，是软骨分解与合成代谢失衡的结果［2］，此类疾病多发于中年以后的慢性、退行性关节疾病，膝关节腔多伴有大量积液为多见，临床以四肢(膝关节为甚)疼痛、变形和活动受限为特点。临床特征为关节结构的炎症和肿胀、慢性进行性病程，并可致多个关节完全强直，骨质疏松及关节畸形，并最终导致关节功能的丧失，目前尚无理想的治疗方法。中医认为膝骨性关节炎属“痹证”，“风、寒、湿”合而成痹，此类患者常挟湿气下注于关节［3］。由于软骨分解及合成代谢失衡及筋络脉隧痹阻不通，多继发滑膜与滑液炎，其病理改变多以膝关节滑膜受损及关节腔积液为主［4］，本实验电针配合穴位注射骨瓜提取物注射液治疗类风湿关节炎，旨在挖掘祖国中医药治疗关节炎优势，探讨其作用机制，以期研究联合治疗的镇痛消炎作用机制，为临床提供安全可靠的治疗膝骨关节炎合并关节腔积液治疗方案。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

日本大耳白兔40 只，体质量(2500 ±50)g，雌雄兼用，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证:SCXK(鄂)2011-0008;实验动物设施使用许可证:SYXK(鄂)2011-0031。采用随机数字表编号，随机分为模型组、电针组、骨瓜提取物组及联合治疗组，每组10 只。

1.2 仪器设备及试剂

骨瓜提取物注射液(哈尔滨圣泰生物制药有限公司，批准文号:国药准字H23023507);小牛软骨Ⅱ型胶原加福氏完全佐剂(上海实生细胞生物技术有限公司)。SDZ-II 型电子针疗仪(上海坤弘，型号:SDZ-II)。

1.3 类风湿关节炎动物模型制备

动物造模时先剃掉兔膝关节及以下毛发，碘伏消毒，采用日本鬼头康彦［5］膝骨关节炎造摸法，将小牛软骨Ⅱ型胶原加福氏完全佐剂0.1 mL 于第1、3、7 天注入右膝关节腔内，根据临床上超疲劳容易提前出现关节炎的发病特点，每日强迫动物活动30 min，14 天后出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状即可确定大鼠急性膝关节炎模型造模成功:①关节出现红、肿、热、痛、同时软组织肿胀或积液;②关节及其周围僵硬、活动受限;③发病的部位常见于膝、髋、踝等关节处;④关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软骨表面粗糙，滑膜粘连、增生、肥厚等膝关节炎临床病理学改变;⑤关节积液检查出现HA 降低、PGE2、IL-1β含量明显升高。本实验模型成功率为100%。

1.4 治疗方法

术后14 天造模成功后，分别将兔固定于兔固定器，电针组以电针齐刺为主的针灸治疗方法治疗，取足血海、三里、阳陵泉为主穴用一次性无菌针灸针齐刺，旁开1 寸两旁各刺1 针，其针尖与正中1 针的针尖汇合，刺入骨膜，行导气手法，使针感向膝周扩散为佳;以齐刺点为正极，配穴为负极，接SDZ- II 型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针30 min。骨瓜提取物组肌肉注射骨瓜提取物1 mg/d/kg。联合治疗组取足三里、血海、阳陵泉3 穴为主穴电针刺激30 min 后穴位注射骨瓜提取物。模型组注射生理盐水。以上各组均治疗1 日1 次，连续治疗14 天。

1.5 检验指标及检测方法

参照文献［6］，于治疗前后分别病理检查测定关节滑膜BMPs 及MMP-1 阳性表达率(阳性细胞数/细胞总数×100%)，抽取兔膝关节腔积液，测定积液IL-8、PGE2、HA 含量。

1.6 膝关节肿胀百分率的测定

采用玻璃容器排水法测量造模前及治疗14 天后容积并计算左膝关节肿胀百分率。方法为:先取100 ml量筒注入蒸馏水，液面与量筒最高处平齐，用50 ml注射器吸取量筒内蒸馏水约30 ml。于每只兔左膝关节缝矢状面用记号笔做一标记，然后把兔左足缓慢伸人量筒内，使标记与量筒最高处平齐。再用已吸入30 ml水的注射器向量筒内缓慢注入蒸馏水并使液面再次与最高处及兔膝关节标记处一致，读取注射器内剩余液体体积，再用30 ml-注射器内剩余液体体积即为兔的左膝关节容积，重复3 次取平均值。左膝关节肿胀百分率(%)=(造模后容积-造模前容积)/造模前容积×100%。

1.7 数据统计

2 结果

2.1 治疗前后两组HA、IL-1β、PGE2比较

见表1，在经14 天治疗后，模型组IL-1β、PGE2明显升高，HA 降低，说明炎症反应持续存在，造模成功;电针组HA 升高、IL-1β 降低，但PGE2无明显变化;骨瓜提取物组HA 升高，IL-1β、PGE2含量明显下降，与模型组及电针组比较(P ＜0.05)，差异显著;联合治疗组HA 明显升高，IL-1β、PGE2含量明显下降，与电针组及骨瓜提取物组比较(P ＜0.05)，差异显著。提示:联合治疗组在经电针齐刺后穴位注射骨瓜提取物可明显降低IL-1β、PGE2、促进HA 分泌。

2.2 治疗前后BMPs、软骨细胞MMP-1 阳性表达比较

模型组BMPs 在经14 天治疗后无明显变化，软骨细胞MMP-1 阳性表达明显升高。电针组BMPs 有升高趋势，软骨细胞MMP-1 阳性表达则无明显变化，与治疗前比较无统计学意义。骨瓜提取物组BMPs 明显升高，软骨细胞MMP-1 阳性表达率降低，与模型组及电针组比较(P ＜0.05)，差异显著。联合治疗组在经电针齐刺后穴位注射骨瓜提取物，BMPs 较骨瓜提取物组升高更明显，软骨细胞MMP-1 阳性表达率进一步降低，与电针组及骨瓜提取物组比较(P ＜0.05)，差异显著，见表2。

2.3 治疗前后各组动物足肿胀度、消肿时间比较

见表3，电针组足肿胀度、消肿时间均有一定的降低，与模型组及本组治疗前比较，P ＜0.05，差异有统计学意义。骨瓜提取物组肿胀度、消肿时间较电针组明显缩短，与模型组及电针组比较，P ＜0.05。联合治疗组则明显优于电针组及骨瓜提取物组，P ＜0.05，差异有统计学意义。

表1 治疗前后两组HA、IL-1β、PGE2比较 (±s，n=10)

表1 治疗前后两组HA、IL-1β、PGE2比较 (±s，n=10)

注:与治疗前比较，△P ＜0.05;与模型组比较，▲P ＜0.05;与电针组比较，#P ＜0.05;与骨瓜提取物组比较，* P ＜0.05。

组别HA(μg/L)IL-1β(pg/ml)PGE2(OD)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组 1.39 ±0.20 0.93 ±0.12△ 34.24 ±4.50 50.57 ±6.11△ 0. 92 ±0.09 1.87 ±0.28△电针组 1.43 ±0.21 3.85 ±0.56△▲ 35.29 ±4.33 21.38 ±2.97△▲ 0. 90 ±2.87 0.86 ±0.05骨瓜提取物组 1.40 ±0.19 4.79 ±0.71▲# 34.47 ±4.06 22.29 ±2.83▲# 0. 93 ±0.09 0.57 ±0.06▲#联合治疗组 1.42 ±0.22 6.79 ±0.84#* 36.21 ±4.41 14.36 ±2.45#* 0. 91 ±0.08 0.19 ±0.02#*

表2 治疗前后各组动物BMPs、MMP-1 比较(±s，n=10)

表2 治疗前后各组动物BMPs、MMP-1 比较(±s，n=10)

注:与治疗前比较，△P ＜0.05;与模型组比较，▲P ＜0.05;与电针组比较，#P ＜0.05;与骨瓜提取物组比较，* P ＜0.05。

组别BMPs(ng/L)MMP-1(%)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组7.08±0.73 7.31±0.67 21.01±3.35 29.91±4.01电针组 6. 87±0.61 7.92±0.54 21.93±3.23 19.34±2.41骨瓜提取物组 7.14±0.65 10.62±0.79▲# 20.97±3.17 13.37±2.22▲#联合治疗组 7.03±0.57 13.43±1.94#* 22.01±3.41 8.97±1.04#*

表3 治疗前后各组动物足肿胀度、消肿时间比较(±s，n=10)

表3 治疗前后各组动物足肿胀度、消肿时间比较(±s，n=10)

注:与治疗前比较，△P ＜0.05;与模型组比较，▲P ＜0.05;与电针组比较，#P ＜0.05;与骨瓜提取物组比较，* P ＜0.05。

组别 足肿胀度(%)消肿时间(天)治疗前 治疗后 治疗前 治疗后模型组 35.92±3.78 39.21±4.02 14.21±2.31 13.57±1.95电针组 34.41±3.23 28.34±3.05△▲13.29±2.51 10.31±2.41△▲骨瓜提取物组36.29±3.52 21.39±2.42▲#14.41±2.27 8.34±1.42▲#联合治疗组 35.54±3.23 10.30±1.49#* 13.02±2.10 6.33±1.09#*

3 讨论

中医认为，当膝关节因外伤或其他原因受损伤后，局部关节血瘀气滞，湿浊之气痹阻于膝，治则当针灸以舒筋通络、行气止痛，中药活血化瘀、利湿除痹而达到临床治愈的目的［7］。类风湿关节炎以四肢特别膝关节伴关节积液多见，其病理改变以关节腔及滑膜炎性浸润，造成关节面软骨被破坏、变性并继发滑液炎症，是关节软骨细胞的分解与合成代谢紊乱造成的慢性、退行性关节疾病［8］。临床上多发于35 岁以上的中年人，临床以膝关节疼痛、变形和活动受限为主要特点，目前治疗办法多以抗炎消肿为主，但疗效并不理想［9］。

HA 是关节滑液和软骨基质的重要组成部分，主要为由N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖和D-葡萄糖醛酸有规律重复构成的大分子链状多糖，HA 可抑制类风湿关节炎时关节腔内IL-1β 及PGE2等炎性介质的合成及扩散，降低滑膜的通透性，减少关节腔内渗液渗出［10］。IL-1β、PGE2是机体的主要炎症因子，正常情况关节中可检出微量IL-1β、PGE2，在患类风湿性疾病时，IL-1β 及PGE2含量则会异常增高。正常关节滑液和软骨中BMPs 分化较高，MMP-1 细胞阳性表达极低。故本实验研究采用电针配合穴位注射骨瓜提取物治疗类风湿性关节炎动物模型，以HA、IL-1β、PGE2、BMPs 及MMP-1 细胞阳性表达率为主要生化指标来衡量该治疗方案的疗效。

实验中选用日本大耳白兔血海、足三里、阳陵泉3穴，是因为阳陵泉可强筋祛湿，主治膝痹;足三里具有养血益气之功效，主治下肢痿痹;而血海穴主活血，与阳陵泉及足三里配伍具有舒筋活络、利通关节之效［11］。结果显示，联合治疗组兔在经过14 天电针血海、足三里、阳陵泉后，PGE2、MMP-1 细胞阳性表达率、足肿胀度及消肿时间均有不同程度的降低和缩短，这可能与电针刺激可激发经气、促进局部血液循环及局部病变组织新陈代谢、降低痛阈、减轻关节滑膜表面神经神经末梢对炎性因子IL-1β、PGE2刺激的反应敏感度有关。本实验结果与周效思等［12］研究威灵仙能明显延长小鼠热板痛阈时间和显著减少小鼠扭体反应的次数相吻合。联合治疗组兔在配合外敷威灵仙浸膏，HA 较单用电针刺激及威灵仙外敷增高明显，IL-1β、PGE2及MMP-1 进一步降低，这可能是威灵仙浸膏外敷后通过皮肤吸收，促使滑膜内衬B 型滑膜细胞和单核吞噬细胞大量分泌HA，以达到润滑关节、延缓软骨退变及保护关节软骨的作用。同时，中药吸收后还可抑制机体产生过多的IL- lB 及PGE2等炎症因子，降低滑膜的通透性及因炎症刺激而造成MMP-1细胞阳性表达，这对减轻IL-1β 及PGE2等对关节软骨细胞的破坏、减少关节内渗出液及炎性反应起到至关重要的作用。

由于骨瓜提取物注射液中富含多种游离氨基酸，为成骨细胞合成BMPs、TGF-β 等骨源性生物因子提供能量和原料，促进骨源性生物因子的合成。实验证实骨瓜提取物注射液中的多肽类骨代谢因子增加BMPs 的合成，抑制MMP-1 过度表达。本研究认为其促进BMPs 的合成的主要药理作用是促进成骨细胞有丝分裂及趋化作用［13］。BMPs 作为一种骨诱导因子，是间充质细胞向骨系细胞转化的信号传导介质，具有诱导间充质细胞转化为成骨细胞和软骨细胞的作用。同时，BMPs 还可通过调节TGF-β 和FGF 而诱导新骨形成，从而促进钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防治和改善骨质疏松的发生［14］。骨瓜提取物注射液中的甜瓜籽提取物能降低关节局部毛细血管通透性，减少IL- 1β 合成及炎性渗出，降低因炎症刺激而造成MMP-1 细胞阳性表达，促进局部炎症及组织粘连时血运障碍的恢复，改善关节局部的血液循环。总之，骨瓜提取物注射液通过调节关节积液中HA 及IL-1β含量、滑膜BMPs 及MMP-1 阳性表达，影响关节及骨代谢，刺激成骨细胞增殖，调节钙、磷代谢，增加钙沉积，防治骨质疏松［15］，缩短消肿时间，清除关节腔内炎性因子而起到活血化瘀、祛风除湿、消肿抗炎镇痛的目的，改善关节腔内环境而达“通则不痛”的功效［16］。

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