食源性致病菌检测新方法

杨兴国

近年来食品安全得到了世界各国的普遍关注。每年向卫生部上报的食物中毒人数逐年递增，且大部分是由食源性致病菌所引起。据世界卫生组织估计，全世界每年的食源性疾病患者中，70%都是由致病性微生物引起的。由此可见，食源性疾病与食品污染问题已成为世界范围内举足轻重的公共卫生问题。同时，GB 29921-2013《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》于2014年7月1日实施，对食品中致病菌的规定更加严格。所以建立有效的食源性致病菌检测体系，快速并且准确地完成对食品中致病菌的检测已成为保障食品安全和防止疾病传染的关键。

随着生物技术的进步，除了传统检测方法外，在食源性致病菌检测领域出现了许多比传统方法更快捷、敏感性更好的新技术，如免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。本文对目前国内外食源性致病菌的检测方法进行归纳和综述，并对不同方法进行阐述和分析。

免疫学方法

检测食品中致病菌的免疫学方法主要有免疫扩散法、反向间接凝血试验（即HA）、反向被动乳胶凝集试验（RPLA）、放射免疫法（RIA）、免疫荧光技术（IFT）、酶联免疫吸附法（ELISA）等。

最初应用的免疫学方法为免疫扩散法，它主要分为单向免疫扩散试验和双向免疫扩散试验，但这两种方法的检出灵敏度较低，检测的食品标本需要浓缩，操作量大、工作繁琐，因而未能推广。RIA的应用将同位素测定的高灵敏性和抗原抗体反应的高特异性有效地结合在一起，使得其检测的灵敏度和特异性均有所提高而且具有简单、快速的特点。RIA测定食品标本不需要浓缩，1～2d内可出结果，检测各种食品中的金黄色葡萄球菌的灵敏度为1～10ng/g，但该方法存在放射性污染和需要专门的防护设备、检测仪器等问题，也不易推广。

免疫荧光技术（IFT）是在将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应，可用来对葡萄球菌、大肠杆菌0157、沙门氏菌和单核增生李斯特氏菌等进行快速检测。此方法的主要特点是特异性强、敏感性高、速度快。但存在一些不足尚未完全解决，如非特异性染色问题，结果判定的客观性不足，技术程序比较复杂。

ELISA方法是一种敏感、快速、简单的方法，应用较广。酶联免疫吸附技术的基本原理是将抗原或抗体预先吸附于固相载体表面，再加入受检样品和酶标抗体，进行免疫酶染色，最后经固相载体上的酶催化产生颜色变化，从而判断受检样品是否含有目的抗原。同时通过分析有色产物量可以确定样品中待测物质的含量。国内外学者采用酶联免疫吸附技术对不同的细菌进行检测，实验结果表明ELISA法对多种食源性致病菌的灵敏度和特异性较好。但ELISA对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，且对结构类似的化合物有交叉反应。

基因芯片技术

基因芯片技术是上个世纪末诞生的一项新型生物技术。它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特异微生物。其检测致病菌原理为：选择细菌的共有基因作为靶基因，用一对通用引物进行扩增，再利用芯片上的探针检测不同细菌在该共有基因上的独特碱基，从而区分不同的细菌，此法还可以通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应的探针来逐步扩大基因芯片的检测范围，并通过增加和调整探针来逐步提高基因芯片的准确性。基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病菌，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，检测的灵敏度、特异性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。

核酸探针技术

核酸探针检测技术的依据是核酸杂交，其工作原理是两条碱基互补的DNA链在适当的条件下可以按碱基互补配对原则，形成杂交DNA分子。已知每个生物的各种性质和特征都是由其所含的遗传基因所决定，因此，从理论上讲，任何一个决定生物体特定生物学特征的DNA序列都应该是独特的。通过将微生物的特征基因的一条DNA链进行标记，即可制成DNA探针。标记的方法可分为两种：放射性标记探针和非放射性标记探针。放射性探针是以同位素为标记物，常用的同位素包括32P、3H、35S，通过放射自显影检测分析结果；非放射性探针是以生物素、酶和荧光素等为标记物，杂交后通过酶催化底物显色反应、荧光显微镜或荧光仪检测杂交结果。用大肠杆菌编码葡萄糖醛酸酶的uidA基因设计探针，用以检测食品中的总大肠杆菌。

光学生物传感技术

光学生物传感器源于传统的物理传感器，它将反应产生的化学信号转换为光信号，其最大的优点是抗外界干扰能力强。光学生物传感器的检测模式有吸收、反射、化学发光、荧光和磷光等，在致病菌检测中最有应用前景的技术包括表面等离子共振技术等。表面等离子共振技术是一种基于反射光谱的非标记检测技术。它将已知生物分子固化在几十纳米厚的金属膜表面，加入能够与之结合的目标生物分子，由此引发的光学信号随机被表面等离子共振传感器转化为电信号进行检测分析。

聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术是在体外合适条件下，以DNA为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在耐热DNA聚合酶作用下特异性扩增目的DNA片段的技术。近年来应用PCR技术检测食源性致病菌的技术有很多，如常规PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR、逆转录PCR、不对称PCR、免疫PCR、套式PCR和电化学发光PCR等。多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种DNA扩增技术。多重PCR在同一反应体系中同时加入多对引物，扩增多条目的DNA片段，所以可以同时检测多个目标菌。相对于传统检测方法，多重PCR检测技术可以极大地缩短检测时间，且操作简单、特异性和敏感度较高。因此采用多重PCR方法检测多种细菌一直是细菌快速检测的研究热点。但是多重PCR技术在实际的检验工作中还存在一些问题：如提取得到的DNA片段可能不完整，多组引物之间的相互干扰，高浓度模板对低浓度模板产生竞争性抑制以及样品中可能含有PCR抑制物质等。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出。实时荧光PCR是在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的强弱来实时反应模板的扩增量，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光PCR技术采用全密闭管检测，不仅实现对DNA模板定量，还能避免电泳带来的误差和污染，具有重复性好、自动化程度高、实时性强和准确性高等特点。实时定量PCR类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性好；而非探针类是利用染料或特殊设计引物指示扩增产物增加，特异性不强，但简便易行。目前在国内外实时荧光定量PCR广泛应用于基因表达研究、病原体检测等领域。

食品安全问题关系到国计民生，随着经济社会的不断发展，必然会对食源性致病菌的检测提出越来越多的要求。传统的细菌培养、分离、鉴定与检测的技术耗时长且检出敏感性差。但使用传统检测方法可获得供后续研究的致病菌菌落，所以该方法仍是食源性致病菌检测的最基本检验方法。

对于食品中的致病菌检测来说，依靠单一的手段已不能满足现阶段的检测要求。多种技术的联用可大大提高检测的灵敏度，并减少检测时间。随着微生物学、生物化学和分子生物学等学科的飞速发展，各种多功能微生物检测系统的研发逐步成为热点。3M分子检测系统就将环介导等温核酸扩增技术（LAMP）和生物荧光实时检测技术（BART）结合在一起，可实现在分子层面上对食源性致病菌准确、高效的检测。随着人们对食品微生物认识的逐步深入，相信会有越来越多的食源性致病菌分析方法和检测技术应用到实际生活中。