成骨生长肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响及其可能机制

韩万伟,唐翔,刘连仲,叶春伶,王晓梅,闫建亮

(北京市回民医院 骨伤科，北京 100054)



成骨生长肽对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响及其可能机制

韩万伟,唐翔,刘连仲,叶春伶,王晓梅,闫建亮

(北京市回民医院 骨伤科，北京 100054)

目的 探讨成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)对MC3T3-E1成骨细胞的增殖的影响及其机制。方法 常规培养小鼠成骨细胞MC3T3-E1，分为OGP高、中、低剂量组(1×10-8、1×10-10、1×10-12mol/L)以及对照组，利用MTT法检测OGP作用24 h、48 h以及72 h对MC3T3-E1成骨细胞增殖作用，利用免疫化学染色法检测成骨细胞I型胶原蛋白水平，ELISA法检测骨桥蛋白(osteopontin，OPN)含量。结果 在24 h时，各剂量OGP对MC3T3-E1的增殖无影响；作用48、72 h，OGP 10-10mol/L以及 OGP 1×10-8mol/L显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P<0.05)，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促进MC3T3-E1细胞增殖作用最强。作用24 h，各组成骨细胞I型胶原蛋白IOD值差异均无统计学意义；作用48 h，OGP 1×10-8mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值显著高于对照组(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-10mol/L组以及OGP 1×10-8mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值均显著高于对照组(P<0.05)。作用24 h，各组成骨细胞OPN OD值差异均无统计学意义；作用48 h、72 h，OGP 1×10-10mol/L组以及OGP1×10-8mol/L组细胞OPN OD值显著高于对照组(P<0.05)。结论 OGP能够明显促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖，其可能的作用机制是增加成骨细胞I型胶原蛋白的表达以及OPN的表达，且其作用与浓度密切相关，在1×10-8mol/L时，其促成骨细胞增殖作用最强。

成骨生长肽；成骨细胞；增殖；机制

1992年Bab等人在研究骨髓再生的过程当中从愈合的骨髓细胞中分离出来一种多肽物质，该物质在体内能够激活造血系统、促进机体骨的合成代谢，而在体外则具有刺激骨髓基质细胞以及成骨细胞增殖、分化的作用，故而将其命名为成骨生长肽(osteogenic growth peptide，OGP)[1-2]。目前研究证实，成骨生长肽能够有效预防骨质疏松，促进机体骨折愈合，并对化疗、放疗后的骨髓抑制有一定的缓解作用，其临床应用前景十分可观[3-4]。研究报道显示[5]，OGP在体外具有促进成骨细胞增殖的作用，但其作用机制至今尚未阐明，本研究旨在探讨分析OGP对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 小鼠成骨细胞MC3T3-E1由本实验室保存，培养液为含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，培养环境为37 ℃、5%CO2。培养中观察细胞的形态以及培养基颜色的变化情况，当显微镜下细胞视野在80%～90%融合时，给予传代处理。

1.2 仪器与试剂 日本Nikon TE300倒置显微镜，贝克曼有限公司BECKMAN Allegra X-15R 离心机，北京鼎国生物科技有限公司35 μM细胞过滤器。

成骨生长肽购于上海益众生物技术有限公司，其纯度在97%以上。DMEM培养基购自GIBCO公司，优质胎牛血清购自GIBCO公司，胰蛋白酶购自美国Sigma公司，二甲基亚砜购自美国Sigma公司，MTT购自于美国Sigma公司，兔抗鼠I型胶原蛋白抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，生物素化山羊抗兔抗体购于武汉博士德生物工程有限公司，DAB试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组：实验分为4组：OGP 3个剂量组：OGP 1×10-12mol/L组，OGP 1×10-10mol/L组，OGP1×10-8mol/L组；对照组：正常培养细胞，不加入OGP药物。每组设复孔6个。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖：将培养的MC3T3-E1细胞经0.25%胰酶消化后，用含有10%胎牛血清的培养基重悬，将其转入6孔板中，细胞密度为1×107个/孔，按照上述分组加入药物，分别处理24 h、48 h以及72 h，终止药物作用之后，弃去培养基，在各孔细胞中使用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)洗涤2次，然后加入2 mL DMEM培养基以及200 μL MTT，于37 ℃下继续培养4 h，然后将培养基弃去，每孔加入450 μL DMSO，轻轻晃动溶解紫色结晶，然后将混匀后的DMSO 150 μL吸入96孔板中，继续振荡10 min后使用酶标仪检测490 nm处的OD值。

1.3.3 免疫化学染色法检测I型胶原蛋白：在6孔板中制备细胞爬片，待细胞贴壁生长良好之后使用无血清培养基继续培养24 h，然后分别加入1×10-8mol/L、1×10-10mol/L、1×10-12mol/L OGP，对照组不加入OGP，药物加入之后分别培养24 h、48 h以及72 h后取出细胞爬片，采用细胞免疫化学染色法检测各组I型胶原蛋白的表达情况。一抗为I型胶原蛋白兔抗鼠多克隆抗体，稀释倍数为1:500，二抗为链酶亲和素化山羊抗兔IgG，稀释倍数为1:2000，使用PBS代替一抗作为阴性对照，以排除内源性污染所导致的非特异性反应，避免出现假阳性结果。

细胞染色后采用图像分析系统对染色情况进行检测，在200倍显微镜之下按照系统抽样法随机选择每张切片的4个视野进行观察，观察棕黄色阳性细胞颗粒的总面积以及棕黄色阳性颗粒的平均透光度，然后计算出每个切片的平均IOD值(即为阳性染色强度)。平均IOD=平均阳性面积×平均透光度。

1.3.4 ELISA法检测OPN含量：OPN含量的检测参照OPN检测试剂盒操作说明书进行。首先建立标准曲线，设置空白对照。在待测孔中每孔加入100 μL样品后混匀，然后将反应板置于37 ℃条件下90 min，除零孔外每孔加入50 μL一抗工作液，然后置于37 ℃条件下60 min。洗板，除零孔外每孔加入100 μL酶标抗体工作液，37 ℃条件下反应15 min，然后每孔中加入50 μL终止液后混匀，使用酶标仪检测450 nm处的OD值。

2 结果

2.1 OGP对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响 在24 h时，各剂量OGP对MC3T3-E1的增殖无显著影响；作用48 h、72 h，OGP 1×10-10mol/L以及OGP 1×10-8mol/L显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P<0.05)，而OGP 1×10-12mol/L对MC3T3-E1细胞增殖无影响，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促进MC3T3-E1细胞增殖作用最强。见表1。

表1 OGP对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响Tab.1 The effect of OGP on proliferation of osteoblast ±s)

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与OGP 10-12mol/L组比较，compared with OGP 10-12mol/L group；△P<0.05，与OGP 10-10mol/L组比较，compared with OGP 10-10mol/L group

2.2 OGP对MC3T3-E1成骨细胞I型胶原蛋白水平的影响 OGP对MC3T3-E1成骨细胞I型胶原蛋白水平的影响，见图1、图2，作用24 h，各组成骨细胞I型胶原蛋白IOD值差异均无统计学意义；作用48 h，OGP 10-8mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值显著高于对照组(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-8mol/L组以及OGP 1×10-10mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值均显著高于对照组(P<0.05)。

图1 OGP对MC3T3-E1成骨细胞I型胶原蛋白水平的影响*P<0.05，与对照组比较Fig.1 The effect of OGP on collagen I levels of osteoblast MC3T3-E1*P<0.05，compared with control group

图2 MC3T3-E1成骨细胞I型胶原蛋白免疫组化染色结果Fig.2 Immumohistochemical staining of collagen I in osteoblast MC3T3-E1

2.3 OGP对MC3T3-E1成骨细胞骨桥素(OPN)含量的影响 OGP对MC3T3-E1成骨细胞OPN水平的影响见图3，作用24 h，各组成骨细胞OPN OD值差异均无统计学意义；作用48、72 h，OGP 1×10-8mol/L组以及OGP 1×10-10mol/L组细胞OPN OD值显著高于对照组(P<0.05)。

图3 OGP对MC3T3-E1成骨细胞OPN的影响*P<0.05，与对照组比较Fig.3 The effect of OGP on OPN of osteoblast MC3T3-E1*P<0.05，compared with control group

3 讨论

成骨生长肽是一种存在于血清中的内源性多肽，其最早于20世纪90年代由损伤后再生骨髓的培养基中分离纯化而来。经过十余年的研究，对其生化学以及生理学的特性已经有了一定程度的了解，OGP及其类似物能够促进成骨以及骨髓的全系造血，在某些血液疾病上，OGP已经接近临床应用阶段[6-7]。体外研究显示[8-9]，OGP能够促进体外成骨细胞的增殖，但是其作用机制至今尚未阐明。徐杨等[10]研究报道显示，在没有地塞米松的情况下，体外培养的骨髓间充质干细胞使用OGP处理之后，在蛋白水平以及mRNA水平上均检测到了碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin)2种成骨性标志的表达，并产生了钙化结节，表明OGP促使骨髓间充质干细胞向成骨方向转化。并且其研究结果显示，OGP的促成骨能力与浓度密切相关，各浓度之间的促成骨作用具有着明显差异，OGP浓度在1×10-9mol/L时其促成骨能力最强。

本研究探讨分析OGP对小鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖作用，并探讨其可能的作用机制，研究结果显示，在24 h时，各剂量OGP对MC3T3-E1的增殖无影响；作用48 h、72 h，OGP 1×10-8mol/L以及OGP 1×10-10mol/L显著促进MC3T3-E1细胞增殖(P<0.05)，而OGP 1×10-12mol/L对MC3T3-E1细胞增殖无影响，其中OGP 1×10-8mol/L 48 h促进MC3T3-E1细胞增殖作用最强。表明OGP具有促进MC3T3-E1成骨细胞增殖的能力，且其促进增殖能力与OGP的作用时间以及浓度有关，这与国内外相关报道相吻合[11-12]。

研究证实[13-14]，I型胶原蛋白是机体形成骨机械力量的一种主要因素，其有序排列的胶原纤维越多，则新形成的骨强度就越强，因此，分析OGP对细胞胶原蛋白合成的影响，对明确OGP促成骨能力以及作用机制有着重要的意义。本研究采用免疫细胞化学染色法检测I型胶原蛋白的水平，研究结果显示，作用24 h，各组成骨细胞I型胶原蛋白IOD值差异均无统计学意义；作用48 h，OGP 1×10-8mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值显著高于对照组(P<0.05)；作用72 h，OGP 1×10-8mol/L组以及OGP 1×10-10mol/L组细胞I型胶原蛋白IOD值均显著高于对照组(P<0.05)。表明OGP作用后，能够明显增强MC3T3-E1成骨细胞I型胶原蛋白的表达，且其对I型胶原蛋白的促进作用与OGP的浓度相关。成骨细胞中I型胶原蛋白表达的增加，既能够促进骨形成，又能够提高新生成的骨机械力学的性能，具有重要的生理学意义。

OPN是一种分泌型的糖基化磷蛋白，它作为一种成骨细胞分化的早期标志，在矿化的过程中能够调节羟磷石灰晶体的生长[15]。本研究结果显示，作用24 h，各组成骨细胞OPN OD值差异均无统计学意义；作用48 h、72 h，OGP 1×10-8mol/L组以及OGP 1×10-10mol/L组细胞OPN OD显著高于对照组(P<0.05)。表明OGP能够促进MC3T3-E1成骨细胞OPN的表达，提示OGP可能是通过促进OPN表达来促进细胞的增殖和分化。

综上所述，OGP能够明显促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖，其可能的作用机制是增加成骨细胞I型胶原蛋白的表达以及OPN的表达，且其作用与浓度密切相关，在1×10-8mol/L时，其促成骨细胞增殖作用最强。

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(编校：王俨俨)

Effect of OGP on osteoblast MC3T3-E1 proliferation and its possible mechanism

HAN Wan-wei,TANG Xiang,LIU Lian-zhong,YE Chun-ling,WANG Xiao-mei,YAN Jian-liang

(Department of Orthopedics, Beijing Moslem People’s Hospital, Beijing 100054, China)

ObjectiveTo investigate the effect of OGP on osteoblast MC3T3-E1 proliferation and its possible mechanism.MethodsRat osteoblasts MC3T3-E1 were routine cultured which were divided into high-, middle-, low-dose group of OGP(1×10-8, 1×10-10, 1×10-12mol/L)and control group.Proliferation of osteoblast MC3T3-E1 were detected by MTT method, collagen I level by immunohistochemical staining,and osteopontin (OPN) content by ELISA after cultured with OGP for 24 h, 48 h, and 72 h.ResultsOGP in each dose had no significant effect on proliferation of MC3T3-E1 at 24 h.OGP 10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L significantly improved the proliferation of MC3T3-E1 at 48h, 72 h (P<0.05), and OGP 1×10-8mol/L was the most obvious at 48 h.IOD values of collagen I had no significant difference of OGP in each dose at 24 h.IOD values of collagen I in OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 48 h (P<0.05), and IOD values of collagen I in OGP 1×10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 72 h, respectively (P<0.05).OD values of OPN had no significant difference of OGP in each dose at 24 h.OD values of OGP 1×10-10mol/L and OGP 1×10-8mol/L group was significantly higher than that of control group at 48 h, 72 h, respectively (P<0.05). ConclusionOGP can significantly promote proliferation of MC3T3-E1 osteogenic cell, its possible mechanism is to increase the expression of osteoblasts collagen I and OPN expression, and the effect is closely related to concentration, the proliferation of osteoblast MC3T3-E1 in OGP 1×10-8mol/L is fastest.

osteogenic growth peptide; osteoblast; proliferation; mechanism

韩万伟，男，本科，主治医师，研究方向：骨科，E-mail：hww123123123@163.com。

R681

A

1005-1678(2015)02-0071-04