N-乙酰半胱氨酸对心衰兔氧化应激和核因子NF-κB的干预研究

李燕,万汝根

(1.南阳市中心医院 心内二科，河南 南阳 473000；2.东阳市人民医院 心内科，浙江 东阳 322103)



N-乙酰半胱氨酸对心衰兔氧化应激和核因子NF-κB的干预研究

李燕1,万汝根2

(1.南阳市中心医院 心内二科，河南 南阳 473000；2.东阳市人民医院 心内科，浙江 东阳 322103)

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸对心衰兔氧化应激和核因子NF-κB的干预研究。方法 40 只健康成年大白兔，耳缘注射阿霉素制作心衰模型。8周后取造模成功的27只大白兔随机分为心衰组(n=14)和N-乙酰半胱氨酸组(NAC组，n=13)，另取10只为对照组。对照组和心衰组给予注射生理盐水1 mL/(kg·d)，NAC组给予注射NAC 300 mg/(kg·d)。干预4 周后，测定各组兔超声心动图参数(LVEDD、LVESD、IVST、EF、FS)、血清及心肌组织总抗氧化能力；酶联免疫检测各组兔血清和心肌组织8-iso-PGF2α的含量；免疫组化和Western blot 检测NF-κB p65及其抑制物IκB-α在左室心肌细胞的表达和核结合活性的改变。结果 与对照组相比，心衰组兔左室舒张期末内径(LVEDD)、左室收缩期末内径(LVESD)明显增大(P<0.05)；射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)明显降低(P<0.05)，室间隔厚度(IVST)未见明显变薄。心衰组血清和心肌的总抗氧化能力均低于对照组(P<0.01)；与心衰组比较，NAC干预组总抗氧化能力明显升高(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义。NAC注射组较心衰组心肌细胞NF-κB p65向核内移位表达的阳性细胞明显减少，NAC治疗后兔心肌细胞NF-κB p65的表达较心衰组减少(P<0.05)，IκB-α表达较心衰组多(P<0.05)。心衰后给予NAC干预的兔血清和心肌组织8-iso-PGF2α含量较心衰组显著降低(P<0.05)，血清和心肌8-iso-PGF2α的含量均与心功能显著相关(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05)。结论 氧化应激参与了心力衰竭的发生和心功能的恶化；NAC 可通过抑制氧化应激，拮抗NF-κB的活化和其在核内的表达，减少心肌细胞凋亡及炎症反应，有效改善心功能，保护心肌。

心力衰竭；NF-κB；细胞凋亡；氧化应激；N-乙酰半胱氨酸

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一种巯基化合物抗氧化剂，为谷胱甘肽的前体，能增加细胞内谷胱甘肽的含量，稳定细胞膜，保护细胞活性，还可直接清除活性氧， 已经证实它能对抗缺血再灌注等病理状态下因活性氧所引起的细胞凋亡[1]。NAC具有强大的抗氧化活性，同时也是一种NF-κB的抑制剂，目前作为心、脑缺血再灌注损伤的保护剂被人们重新认识。它在减轻缺血再灌注损伤的同时对心力衰竭是否有影响，其对心衰中NF-κB是否影响心肌细胞的凋亡，心力衰竭的发生发展是否与其复杂的药理作用机制有关，关于这方面的研究甚少。本课题在已公认的阿霉素诱导慢性心衰的兔模型基础上，观察兔左室心肌细胞NF-κB的活化、易位和蛋白表达变化与心肌细胞凋亡的关系、凋亡相关因子Bcl-2、Bax、iNOS基因转录和表达变化以及心功能改变，同时对照观察NAC对上述指标的影响，探讨氧化应激及核因子NF-κB在心衰中的发生机制，以期阐明NAC发挥心脏保护的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：50只健康大白兔，雌雄不限，兔龄5～6个月，体质量(2.50±0.35)kg, 购于南京安立默科技发展有限公司，动物合格证号：SYXK(苏)2002-0017。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 主要试剂和试剂盒：盐酸阿霉素注射剂(浙江海正药业股份有限公司，批号050907)，NAC(乙酰半胱氨酸)注射液(杭州民生药业集团有限公司，批号0510081)，磷酸盐缓冲液(pH7.4)，蛋白分子量(Marker Promega 公司)，ECM 显色试剂(武汉博士德生物工程有限公司)，PVDF 膜(美国NEC)，细胞裂解液(Pierce 公司)。

游离脂肪酸试剂盒、乳酸试剂盒和ATP 酶试剂盒、总抗氧化能力试剂盒(南京建成生物工程研究所)，8-iso-PGF2α定量酶联免疫检测试剂盒(纯化的鼠抗兔IgG 包被的微孔板、8-iso-PGF2α抗体和Ache 标记的8-iso-PGF2α抗原及其他试剂组成)、鼠抗兔多克隆NF-κB p65、IκB-α 抗体(北京中山生物技术有限公司)，NF-κB、IκB-α兔SP试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，免疫组化SABC试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 心力衰竭动物模型的制备和分组：随机选取40 只健康大白兔，根据Dorr RT文献[2]将盐酸阿霉素用生理盐水稀释成1 mg/mL溶液，耳缘静脉注射，每次按1.0 mg/kg体质量给药，每周2次，连续8周，制作兔心衰模型。取造模8周后成功的27 只大白兔随机分为心衰组(n=14)和NAC 干预组(n=13)，NAC组给予NAC注射液300 mg/kg，耳缘静脉注射，每天1次，共4 周，对照组与心衰组均注射等体积生理盐水。剩余10只大白兔设为对照组，耳缘静脉注射生理盐水1 mL/kg，每周2 次，连续8周。实验动物单笼喂养，自由饮水。定期称体质量，以上3组实验周期为12周，各组动物年龄、体质量差异均无统计学意义。

1.2.2 超声心动图检查：37只大白兔均在12周末进行超声心动图检查。检查前剪去胸前绒毛并肌肉注射安定2 mg镇定。切面选择常规胸骨旁左室长轴切面二维条件下测量左房和左室内径、左室舒张期末内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收缩期末内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)和室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)，乳头肌水平短轴切面行M型取样以计算射血分数(ejection fraction，EF)和短轴缩短率(fraction shortening，FS)、胸骨旁四腔和观察室壁运动，肺动脉长轴切面测量肺动脉内径和频谱。取心尖三腔、四腔或五腔切面测量主动脉和二尖瓣频谱。

1.2.3 血清及心肌组织总抗氧化能力(TAOC)测定：动物处死前留取2 mL静脉血，以3500 r/min离心15 min后留取血清，放于低温冰箱保存(-20 ℃)备用。取液氮冻存的左心室肌称重后，于冰浴中剪碎，制备成10%的心肌组织匀浆液，将匀浆1000 r/min离心10 min后留取上清液，分别测定血清及心肌组织中TAOC(采用比色法)。

1.2.4 定量酶联免疫检测兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量：采用抗原竞争EIA 法(美国Cayman 化学公司)。实验结束处死动物前留取2 mL静脉血，4000 r/min离心15 min取上层血清，-80 ℃保存备用。取液氮冻存的左心室肌组织，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含0.1 mmol的EDTA)，用匀浆器制成组织匀浆液，将匀浆4000 r/min离心15 min后留取上清备用，检测8-iso-PGF2α。

2 结果

2.1 N-乙酰半胱氨酸对心衰兔氧化应激的干预作用

2.1.1 3组动物超声心动图各参数值比较：经胸超声心动图结果：与对照组相比，心衰组兔左室舒张期末内径、左室收缩期末内径均增大(P<0.05)；射血分数与短轴缩短率降低(P<0.05)，室间隔厚度未见明显变薄，见表1。NAC组上述各指标较对照组差异无统计学意义。

表1 3组动物超声心动图各参数值比较±s)Tab.1 Comparison of each parameter value of echocardiography parameters among three ±s)

#P<0.05，与对照组比，compared with control group；*P<0.05，与心衰组比，compared with heart failure group

2.1.2 血清及心肌组织总抗氧化能力的变化：心衰组血清和心肌的总抗氧化能力均低于对照组(P<0.01)；与心衰组比较，NAC干预组总抗氧化能力明显升高(P<0.05)，与对照组比较差异无统计学意义。见表2。

表2 3组动物血清及心肌组织TAOC比较±s)Tab.2 Comparison of TAOC in serum and myocardial tissue among three ±s)

#P<0.05，与对照组比，compared with control group；*P<0.01，与心衰组比，compared with heart failure group

2.1.3 血清和心肌8-iso-PGF2α的含量变化：从表3可知，兔心衰后血清和心肌组织8-iso-PGF2α水平明显高于对照组(P<0.05)，而心衰后给予NAC干预的兔血清和心肌组织8-iso-PGF2α的含量较心衰组显著降低(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.001)。

表3 3动物血清及心肌组织8-iso-PGF2α含量比较Tab.3 Comparison of serum and myocardial tissue 8-iso-PGF2αcontents among three ±s,pg/mg)

#P<0.05，与对照组比，compared with control group；*P<0.05，与心衰组比，compared with heart failure group

2.1.4 8-iso-PGF2α与心功能的相关性：直线相关分析结果显示：血清和心肌组织的8-iso-PGF2α水平之间存在着直线关系(F=220.59，P<0.005)，相关系数为0.975，具有显著意义(P<0.005)。氧化应激指标血清和心肌8-iso-PGF2α与心功能相关分析结果显示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平与心功能指标LVEDP、±dp/dtmax呈显著直线相关，与其中LVEDP增高程度平行(P<0.01)，与±dp/dtmax均呈显著负相关(P<0.001)，说明阿霉素诱导心衰兔中的血流动力学恶化与氧化应激有关。见表4。

表4 8-iso-PGF2α与心功能的相关性Tab.4 Correlation of 8-iso-PGF2α and cardiac function

2.2 N-乙酰半胱氨酸对兔心衰中核因子NF-κB的干预作用 NAC对心衰兔心肌细胞NF-κB p65蛋白结合活性的影响：对照组NF-κB p65主要存在于胞质，无明显核表达。心衰组可见NF-κB p65大量活化，从胞质移位于细胞核内，NF-κB p65蛋白在心肌细胞核内的表达较对照组增多。NAC注射组较心衰组心肌细胞NF-κB p65向核内移位表达的阳性细胞减少。见图1。

图1 各组NF-κB p65蛋白免疫组化染色结果(×400)Fig.1 Immunohistochemical staining results of NF-κB p65 protein in each groups (×400)

心肌细胞NF-κB p65和IκB-α蛋白表达的变化： SDS-PAGE凝胶电泳照片,见图2。心衰组兔左室心肌NF-κB p65蛋白表达高于正常组(P<0.05)，IκB-α蛋白低于正常组(P<0.05)；NAC治疗后兔心肌细胞NF-κB p65蛋白表达较心衰组减少(P<0.05)，IκB-α表达较心衰组增多(P<0.05)，但与对照组之间差异无统计学意义。

图2 3组心肌NF-κB p65和IκB-α蛋白表达比较1，2 ：正常组；3，4：心衰组；5，6：NAC组#P<0.05，与对照组比；*P<0.05，与心衰组比Fig.2 Comparison of myocardial NF-κB p65 and IκB-α protein expression among three groups1,2:control group;3,4: heart failure group;5,6:NAC group#P<0.05, compared with control group;*P<0.05, compared with heart failure group

3 讨论

很多种疾病在其病理发展过程中大都伴有超氧自由基的生成，它们能引起脂质过氧化造成组织损伤。近年来，人们已建立了一些反映体内氧自由基的生化指标，如超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)等，但它们易受体内外因素的影响，其特异性和敏感性均较低[3-5]。且测定结果不稳定，不能准确反映体内真实水平，临床意义有限。异构前列腺素(iso-PGF2α)是一种具有生物活性的拟前列腺物质，通过非环氧化酶催化的自由基分解机制，损伤脂质细胞膜花生四烯酸后，经自由基脂质过氧化作用产生的特异性产物，性质稳定，这一代谢途径不受阿司匹林、吲哚美辛等的影响，只与氧自由基有关，在氧化性水平升高的情况下大量生成，在体液内含量非常稳定。Iso-PGF2α是一组异构体衍生物，其中含量最高的是8-表氧-PGF2α(8-iso-PGF2α)，目前研究的主要成分是8-iso-PGF2。因此8-iso-PGF2α被认为是一种反映氧自由基增加所致的脂质过氧化作用有较高敏感和特异性的生化指标，也是临床上作为评价抗氧化剂疗效的较理想生化指标[6]。

从实验结果看出，注射阿霉素后兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量增多，总抗氧化能力下降，说明用药后发生了氧化应激，直线相关分析显示血清和心肌组织8-iso-PGF2α水平之间存在着直线关系，说明血清8-iso-PGF2α水平可以反映心肌氧化应激的程度。而8-iso-PGF2α与心功能进行相关分析的结果显示：血清和心肌8-iso-PGF2α水平与心功能指标LVEDP、±dp/dtmax呈显著直线相关，心功能下降与氧化应激关系密切，随着氧化应激的加重，心功能受损也越严重，最终导致心力衰竭的发生。同时，本实验对心衰兔进行了为期4周的NAC药物干预后，观察到NAC明显升高了血清及心肌总抗氧化能力，且血清和心肌组织中变化保持一致，降低了心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量，从而降低了体内氧化应激的水平，推测NAC改善心功能的内在机制可能为：直接清除过多的活性氧，抑制体内的氧化应激状态，提高心肌的抗氧化能力，改善心衰的血流动力学指标，从而改善心功能。本研究结果也显示在心衰兔心肌中IκB-α蛋白水平降低，并存在NF-κB 持续渐活化增多，表明 NF-κB p65的激活与心肌细胞凋亡有关。NAC不仅是抗氧化剂，还是半胱氨酸和谷光甘肽的前体，后一个特性使得NAC与其他抗氧化剂区别开来，NAC能提高心肌谷光甘肽的含量40%，抑制TNF-α介导的ROS活性氧簇的产生[7]，消除高剂量TNF-α对钙瞬变和心电刺激心肌细胞收缩的不良影响。

综上所述， NAC可通过升高血清及心肌总抗氧化能力，降低心衰兔血清和心肌8-iso-PGF2α的含量和NF-κB p54、IκB-α蛋白表达水平，有效改善心功能，保护心肌。

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[3] Wang GW,Klein JB,Kang YJ.Metallothionein inhibits doxorubicin induced mitochondrial cytochrome release and caspase-3 activation in cardiomyocytes [J].JPharmacol Exp Ther,2011,298(2):461-468.

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(编校：王俨俨，吴茜)

Effect of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbits and its mechanism

LI Yan1,WAN Ru-gen2

(1.Department of Cardiology, Nanyang Central Hospital, Nanyang 473000, China; 2.Department of Cardiology, Dongyang People’s Hospital, Dongyang 322103, China)

ObjectiveTo explore the intervention of N-acetylcysteine on oxidative stress and NF-κB in heart failure rabbit and its mechanism.Methods40 healthy mature rabbits with heart failure caused by adriamycin administration through ear venous were modeled.27 rabbits were survival after modeling 8 weeks, and randomly divided into heart failure group (n=14) and N-acetylcysteine group (NAC,n=13).10 another healthy rabbits were chosen as control group.The heart failure group and control group were administrated with saline 1 mL/ (kg·d)and NAC group with NAC 300 mg/ (kg·d).After four weeks, echocardiography parameters (LVEDD，LVESD，IVST，EF and FS), total antioxidant capacity in serum and cardiac muscle tissue of each group were measured.The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardial tissue were detected by ELISA.The change of NF-κB p65 and its inhibitor IκB-α protein expression and nuclear binding activity in the left ventricular myocardial cell were detected by immunohistochemical method and Western blot.ResultsCompared with control group, the left ventricular end diastolic diameter and left ventricular end systolic diameter in heart failure group increased (P<0.05), the ejection fraction and fractional shortening decreased (P<0.05), but interventricular septal thickness was not showing significantly thinner.Total antioxidant capacity in serum and myocardium of heart failure group were lower than those of control group (P<0.01), Compared with heart failure group, the total antioxidant capacity increased in NAC group (P<0.05), and the total antioxidant capacity in control group and NAC group had no statistical difference.The numbers of positive myocardial cells of NF-κB p65 nuclear translocation in NAC group significantly reduced than those in heart failure group NF-κB p65 expression in myocardium of NAC group was lower than heart failure group(P<0.05),and IκB-α expression was higher than heart failure group(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum myocardium of NAC group was significantly lower than that of heart failure group, respectively(P<0.05).The content of 8-iso-PGF2αin serum and myocardium was associated with cardiac function(r=0.975,P<0.005;r=0.974,P<0.05). ConclusionThe oxidative stress is involved in the occurrence and deterioration of cardiac function in heart failure.NAC has strong antioxidant activity, which could inhibit the activation and nuclear expression of NF-κB, reduce apoptosis and myocardial inflammation reaction, and improve cardiac function with myocardial protection.

heart failure; nuclear factor-κB; apoptosis; oxidative stress; N-acetylcystein

浙江省卫生厅(2011KYB151)

李燕，女，硕士，主治医师，研究方向：冠心病介入治疗，E-maili：ly12114@163.com。

R96

A

1005-1678(2015)02-0055-04