开口箭对S-180细胞和实体瘤的抑制作用研究

戚利坤,王俊,刘洪泽,张声林,蔡浩,洪鸣

(1.青海省第五人民医院 肿瘤外科，青海 西宁 810007；2.南京医科大学 医学科学部，江苏 南京 210029)



开口箭对S-180细胞和实体瘤的抑制作用研究

戚利坤1,王俊1,刘洪泽1,张声林1,蔡浩1,洪鸣2

(1.青海省第五人民医院 肿瘤外科，青海 西宁 810007；2.南京医科大学 医学科学部，江苏 南京 210029)

目的 研究开口箭(Tupistra chinensis Baker)对S-180细胞及其实体瘤的抑制作用。方法 SPF级BALB/c-nu小鼠30只，将肿瘤生长良好且小鼠精神状态佳者进行随机分为5组，每组6只：生理盐水组，开口箭低剂量组，开口箭中剂量组，开口箭高剂量组，环磷酰胺(cytoxan,CTX)组。观察细胞形态变化及实体瘤生长状况；用流式细胞术检测各组S-180细胞DNA含量及周期，比较各组对肿瘤细胞生长周期的影响；利用透射电镜观察开口箭干预各组实体瘤细胞超微形态结构的变化。结果 实验结果发现S-180细胞呈圆形或椭圆形，于接种第10天剥取实体瘤，瘤体组织生长良好；开口箭将S-180细胞生长周期阻滞在S期；电镜下开口箭各组细胞形态不规则，染色质凝聚、边缘化，细胞核固缩，与生理盐水组和CTX组比较有明显结构改变。结论 开口箭对S-180细胞及其实体瘤均有明显抑制作用，开口箭阻滞S-180细胞生长周期，导致细胞形态的变化，诱导肿瘤细胞凋亡。

开口箭；S-180细胞；抗肿瘤机制

随着分子生物学和分子药理学在中药单方和复方领域的广泛开展，中药制剂已从宏观到微观，从整体到局部，从整体—部位—成分3个化学层次、从整体动物—组织器官—细胞—分子基因4个药理水平确定药效物质；通过计算机辅助药物设计分析技术，血清药理学和血清药物化学分析方法，谱效关系分析，生物色谱技术，蛋白质组、基因组学系统生物学等研究方法[1]，成功研究出生物碱类、萜类、皂苷类、甾体类、黄酮类、蒽醌类、鞣质类等主要有效成分及其衍生物的药效基团[2]。大量研究总结认为中药抗肿瘤的作用机制主要有：抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡，逆转肿瘤药物的多耐药性，抑制肿瘤血管的生成，抗氧化作用，抑制肿瘤细胞拓扑异构酶活性，抑制直接细胞毒作用，阻断肿瘤细胞迁移通路及基因水平调节以及增强机体的免疫力等等[3-7]。本文以具有清热解毒、散瘀止痛、益气活血等多种功效的开口箭为研究对象，探讨其对S-180肉瘤细胞抑制作用，探讨清热解毒类中药—开口箭抑制肿瘤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 S-180细胞与实验动物 S-180细胞株购于中国生物典型培养物保藏中心(武汉)；SPF级BALB/c-nu小鼠30只，雌性，4～6 w，平均体质量16～20 g，购于武汉大学动物实验中心(合格证号：SCK鄂2008-0004)，在中南医院动物中心喂养，本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.2 主要试剂 RPMI1640美国GIBCO公司；胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司；开口箭饮片涡阳县源和堂中药饮片有限责任公司；环磷酰胺200 mg/支(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号11013121)；氟尿嘧啶250 mg/10mL(天津金耀氨基酸有限公司，批号1012221)；焦碳酸二乙酯(DEPC)美国Sigma公司；二苯基四氮唑溴盐(MTT)碧云天生物技术研究所；DMSO(二甲基亚砜)；化学发光法EMSA试剂盒。

1.3 实验方法

1.3.1 开口箭药物制备：称取开口箭饮片(神农架产区)0.5 kg，自来水浸泡30 min，分煎2次得浓度为0.16 g/mL溶液，冷却后用无菌纱布过滤2次，分瓶置4 ℃保存，体外实验时用0.22 μM微孔针头滤器过滤，并用蒸馏水或者PBS调整至需要浓度，体内灌胃时提前30 min移至室温。

1.3.2 实验动物分组：将肿瘤生长良好且小鼠精神状态佳者进行随机分为5组，每组6只。生理盐水组，在普食的基础上给予生理盐水灌胃；开口箭低剂量组，在普食的基础上给予开口箭0.5 g/kg；开口箭中剂量组，在普食的基础上给予开口箭1 g/kg；开口箭高剂量组，在普食的基础上给予开口箭2 g/kg；以上各组均为灌胃给药。CTX组，在普食的基础上按体质量给予环磷酰胺0.02 g/kg腹腔注射[8]。每天1次，干预2周后，乙醚麻醉剥取肿瘤，并行相关形态学和生化检测。

1.3.3 流式细胞术检测S-180细胞DNA含量及其周期：收集悬浮细胞于5 mL离心管中，1200 r/min离心5 min；倒掉上清液，每管加入1 mL 14 ℃预冷的PBS重悬细胞；转移至1.5 mL的离心管，以1200 r/min，5 min沉淀细胞；倒掉上清液，并轻弹管底，每管加入1 mL 14 ℃预冷的75%乙醇，轻轻吹打混匀，4 ℃固定过夜；以1500 r/min，5 min沉淀细胞，倒掉上清液，并予1 mL 14 ℃预冷的PBS，1500 r/min离心5 min，清洗细胞2次；轻弹管底分散细胞，每管加入0.5 mL的碘化丙啶染色液(加入前约5 min按6个样本的量配制)，轻轻吹打细胞悬液，37 ℃孵育30 min后；用200目筛网过滤，并转移至流式管后上机检测。

1.3.4 电镜切片制作[9]：在无菌条件下取出肿瘤组织，去胞膜，将其切成5 mm方形，用2.5%戊二醛固定液前固定2 h后，用0.1M磷酸缓冲液漂洗3次，然后用1%锇酸后固定90 min，pH 7.2～7.4，固定完毕，用缓冲液漂洗20 min后分别用50%、70%、80%乙醇各1次，每次各15 min，100%乙醇2次，每次15 min进行梯度脱水，然后环氧树脂812包埋，最后用枸橼酸铅进行切片染色。

2 结果

2.1 S-180肉瘤细胞及其实体瘤生长状况 S-180肉瘤细胞呈圆形或椭圆形，均匀悬浮在培养瓶中，生长状态良好，平均每1～2 d传一代。肉瘤细胞接种BALB/c-nu小鼠后于第5 d可见实体瘤突起，于接种第10 d剥取实体瘤，瘤体组织生长状态良好。见图1。

图1 S-180肉瘤细胞及其实体瘤生长状况Fig.1 The growth status of S-180sarcoma cells and solid tumor

2.2 流式细胞术检测S-180细胞周期 碘化丙啶染液能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞膜，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度使细胞核红染，结合细胞的DNA含量分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。由表1可知开口箭对S-180细胞生长周期的阻滞在S期，而且随着浓度的增加阻滞在S期的比例越大，说明开口箭可阻滞细胞生长，诱发S-180肉瘤细胞的凋亡。见表1。

表1 开口箭对S-180细胞周期的影响Tab.1 Effect of Tupistra chinensis on S-180 cell cycle

2.3 透射电镜实体瘤细胞的形态学变化 凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，是多细胞生物生命活动中不可缺少的过程。从形态学上认定细胞变化是最直接判定细胞凋亡的方法。电镜下可见对照组实体瘤细胞体积变小，细胞质浓缩，细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构，甚者有细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，可见凋亡小体；开口箭各组细胞体积无明显缩小，细胞核染色质无明显凝聚边缘化，低、中、高剂量组随着剂量的增加，细胞变化与阳性对照组越接近，见图2。

图2 电镜下各组实体瘤超微结构改变Fig.2 Ultrastructural changes of solid tumor groups under electron microscopy

3 讨论

现代化研究认为中药抗肿瘤机制与多因素有关。高静东等[12]研究认为清热解毒中药具有下调MMP-9表达及上调TIMP-1表达的作用,与养阴、补肾、健脾类中药相比有显著性差异。临床也有诸如白花败酱草提取物对小鼠U14宫颈癌细胞的抑制作用，认为可能与其调节小鼠免疫功能，增强抗氧化防御系统酶活性有关[13]。连翘提物物对大肠癌、胃癌、肺癌等肿瘤细胞均抑制作用，半数抑制浓度平均值为191.88 μg/mL，分析可能与下调细胞中凋亡相关蛋白Survivin mRNA和Bel-2mRNA有关[14]。

本实验证实开口箭对S-180细胞抑制作用，认为开口箭对肿瘤细胞具有抑制作用，可明显抑制S-180肉瘤细胞的增值，阻滞其生长周期。开口箭抗肿瘤的具体有效成分和分子机制，有待于进一步研究。

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(编校：谭玲)

Study on Tupistra Chinensis Baker’s role on inhibiting S-180 cell and solid tumors

QI Li-kun1,WANG Jun1,LIU Hong-ze1,ZHANG Sheng-lin1,CAI Hao1,HONG Ming2

(1.Department of Surgical Oncology, The Fifth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China; 2.Department of Medical Sciences, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo study the Tupistra chinensis Baker’s inhibition on S-180 cells and solid tumors.MethodsSPF 30 BALB/c-nu mice, the tumor growth in mice and good mental state better were randomly divided into 5 groups, 6 rats in each group: normal saline group, Tupistra chinensis Baker low dose group, middle dose group, high dose group, CTX group.The morphological changes of cells and solid tumor growth status were observed;S-180 DNA content and cell cycle in each group were detected by flow cytometry,the changes of ultrastructure of each intervention group were observed by transmission electron microscope.ResultsThe experimental results showed that the S-180 cells were round or oval, inoculation in article 10 d stripping of solid tumors, tumor tissue growth was good; cells were irregular under electron microscope,chromatin condensation and marginalization, karyopyknosis, which had a significant structural change compared with normal saline group and CTX group. ConclusionTupistra chinensis Baker has inhibitory action on S-180 sarcoma cells and solid tumor.Tupistra chinensis Baker-could block S-180 cell cycle, resulting in changes in cell morphology, inducing tumor cell apoptosis.

Tupistra chinensis Baker; S-180 cells; antitumor mechanism

国家自然科学基金(81100352)

戚利坤，男，本科，主治医师，研究方向：肿瘤学，E-mail：qch1821460066@163.com。

R2-031

A

1005-1678(2015)02-0045-03