血必净注射液对急性脓毒症患者Th1/2、内毒素及免疫因子影响研究

方勤，蒋刚健，陈鑫

(1.漯河医学高等专科学校第一附属医院 重症医学科，河南 漯河 462000；2.漯河市医学高等专科学校第一附属医院检验科，河南 漯河 462000)



血必净注射液对急性脓毒症患者Th1/2、内毒素及免疫因子影响研究

方勤1，蒋刚健2，陈鑫2

(1.漯河医学高等专科学校第一附属医院 重症医学科，河南 漯河 462000；2.漯河市医学高等专科学校第一附属医院检验科，河南 漯河 462000)

目的 探讨血必净射液对急性脓毒症患者血清Th1/2、内毒素及脾脏特异性免疫功能的影响及其意义。方法 选取2014年9月～2015年1月于漯河医学高等专科学校第一附属医院确诊为脓毒症的患者110例，根据随机数字表法随机分为2组：对照组55例，行临床常规治疗；实验组55例，在与对照组基础上加用血必净注射液。比较2组患者的血流动力学、血清Th1/2、内毒素及脾脏特异性免疫功能。结果 实验组患者心率低于对照组(P<0.05)，平均动脉压以及中心静脉压高于对照组(P<0.05)，缩血管药物应用低于对照组(P<0.05)，Th1/Th2比值高于对照组(P<0.05)，血清内毒素水平低于对照组(P<0.05)，淋巴细胞增殖、HLA-DR比例高于对照组(P<0.05)，caspase-3细胞阳性指数低于对照组(P<0.05)。结论 血必净注射液能有效改善脓毒症患者血流动力学异常，调节血清Th1/Th2水平，降低血清内毒素水平，提高脾脏特异性免疫功能，对临床治疗脓毒症具有重要意义。

血必净注射液；脓毒症；内毒素；脾脏特异性免疫功能

脓毒症(sepsis)是一种由于严重感染而导致的全身性炎症反应，相关统计发现，全世界每年约有2000例患者被诊断为脓毒症，由于现在医疗抗生素等药物的滥用，其发生率亦呈每年1.6%的增长趋势发展，死亡率约为20%～50%[1]。文献报道[2]，脓毒症因严重感染而导致的患者全身大范围的炎症反应以及对机体各个器官的损害并不是细菌或其产生的内毒素直接导致的结果，而是由于形成重度感染的细菌及其产生的内毒素刺激机体产生大量的炎性介质并且通过“瀑布样”的连锁反应而导致的。近年来研究发现[3]，调节机体免疫状态紊乱在治疗脓毒症时能达到较为满意的疗效。血必净注射液是一种中药制剂，具有“行气活血、祛瘀通络”的疗效，药理研究发现[4]，血必净有良好的抗内毒素、调节免疫反应以及改善微循环的作用。临床亦有将血必净注射液应用于治疗慢性阻塞性肺疾病以及细菌性腹膜炎的报道[5]，应用于治疗脓毒症的文献却鲜有报道。本研究通过对大样本人群进行分析研究，以探讨急性脓毒症患者经血必净注射液治疗后其血清Th1/2、内毒素及脾脏特异性免疫功能的变化，为急性脓毒症患者的及时、有效治疗提供新的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 病例选择2014年9月～2015年1月于漯河医学高等专科学校第一附属医院以急性脓毒症为诊断而收入院的患者110例，采用随机数字表法随机分为实验组和对照组。其中实验组55例，男性28例，女性27例，年龄21～67岁，平均年龄(45.24±7.25)岁；对照组55例，男性31例，女性24例，年龄19～63岁，平均年龄(47.11±6.73)岁。患者一般资料比较差异无统计学意义。本实验获本院伦理协会批准，并全程跟踪。

1.2 诊断及排除标准 诊断标准：参照2003年国际脓毒症定义联席会议制定的诊断标准拟定[6]。脓毒症诊断标准：已证实存在或疑似的感染，且同时具有以下指标，①发烧(温度>38.3 ℃)；②中心体温<36 ℃；③心率>90次/分；④白细胞增多症(WBC>12×109/L)或白细胞减少症(WBC<4×109/L)；⑤动脉低氧血症(PaO2/FIO2<300)；⑥肌酐升高>0.5 mg/dL或44.2 μmol/L。

排除标准：①不愿参与本研究或不符合纳入标准者；②患有急性心肌梗死等危重病者；③患有乙肝、艾滋病等具有较重传染性疾病患者；④合并有严重肝、肾功能不全疾病患者；⑤对血必净注射液过敏的患者；⑥有严重出血倾向者；⑦患有精神类疾病不能配合研究者。

1.3 治疗方法 对照组行抗感染、抗菌药物治疗，保持呼吸道通畅、镇静、镇痛、正性肌力药，血管收缩剂[去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)(上海禾丰制药有限公，国药准字H31021176，生产批号：20120920)]等临床常规方案治疗；实验组在常规治疗基础上加用血必净注射液(天津红日药业股份有限公司，国药准字Z20040033)，60 mL/次静脉滴注，以0.9%氯化钠注射液100 mL稀释，1次/天。2组均共治疗10 d。

1.4 试剂与仪器 肝素(9041-08-1，纯度：>99%，北京赛因坦科技有限公司)；抗CD3+、CD4+抗体、羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物(美国sigma公司)；兔血清(广州蕊特生物科技有限公司)；PBS缓冲液(上海远慕生物科技有限公司)；DAB-H2O2(武汉博士德生物工程有限公司，武汉)；Mayer苏木素复染(北京索莱宝科技有限公司)。

DynaMagTM磁力架(美国life technologies)；guava easyCyte 8流式细胞仪(武汉科力瓦贸易有限公司)；RPMI 1640淋巴细胞无血清培养基(规格：500mL天津灏洋)。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 实验组和对照组患者皆留置上腔中心静脉导管(颈内静脉)。分别于治疗前及治疗10 d后的同一时刻记录心率(heart rate，HR)、平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)以及中心静脉压(central venous pressure，CVP)。

1.5.2 Th1/2检测：所有研究对象均空腹8 h后从肘静脉抽取静脉血8 mL。4 mL置于真空采血管中，于室温下用水平离心机以3000 r/min转速离心20 min，分离血清行基质检测法检测血清中内毒素浓度水平；另4 mL加入肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液法分离后得单个核细胞，并在37 ℃环境下无菌培养0.5 h后，得淋巴细胞悬液；用去离子水溶解淋巴细胞悬液后，行T细胞分离富聚柱法获得纯度较高的的T细胞，各取100 μL加入2试管中，分别加入抗CD3+、CD4+抗体30 μL，混匀后在4 ℃环境下静置30 min，加入缓冲液行上流式细胞仪检测法检测，结果以CD3+、CD4+、CD3O-T细胞反映Th1细胞浓度，以CD3+、CD4+、CD3O+T细胞反映Th2细胞浓度。

1.5.3 脾脏特异性免疫功能检测方法：2组患者在治疗前后行脾脏穿刺获取脾脏组织，行流式细胞仪检测法检测脾淋巴细胞表面白细胞DR抗原(HLA-DR)，具体步骤如下：制备活性高的细胞悬液→用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度5×106～1×107/mL→取40 μL细胞悬液加入预先有特异性单克隆抗体(5～50 μL)(苏州杰思生物技术有限公司)的小玻璃管或塑料离心管，再加50 μL 1:20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清→4 ℃ 30 min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2 mL左右1000 r/min×5 min→弃上清，加入50 μL工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇→4 ℃ 30 min用洗涤液洗涤2次，每次加液2mL左右1000 r/min×5 min→加适量固定液→流式细胞仪检测或制片后荧光显微镜下观察。

1.5.4 脾淋巴细胞caspase-3的阳性指数检测：行免疫组化方法检测脾淋巴细胞caspase-3的阳性指数，具体步骤如下：采集的标本按常规脱蜡，采用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，PBS缓冲液冲洗1次，枸橼酸盐缓冲液热修复后，PBS冲洗1次。按照试剂盒(美国Sigma公司)说明进行非生物素二步法检测，DAB-H2O2显色，Mayer苏木素复染，采用Image-Pro Plus 6.0软件分别检测免疫组化的阳性面积，计算caspase-3阳性指数=阳性面积×平均A值。

2 结果

2.1 患者的一般资料 本研究共收集患者110例，男性59例，年龄46(21～62)岁；女性51例，年龄49(19～63)岁。在各项人口学基本特征数据中，2组患者的性别、年龄、病程、体温、呼吸、心率、血肌酐、白细胞的差异均无统计学意义，见表1。

2.2 治疗后2组患者血流动力学情况比较 经治疗，实验组患者心率明显低于对照组，平均动脉压以及中心静脉压高于对照组，缩血管药物应用低于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 2组患者血流动力学比较±s)Tab.2 Comparison of ±s)

*P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group before treatment；#P<0.05，与对照组治疗后比较，compared with control group after treatment

2.3 2组患者治疗前后Th1/Th2情况比较情况 本研究中，治疗前2组患者Th1、Th2、Th1/Th2计数差异无统计学意义。经10 d治疗后，实验组患者Th1计数明显高于对照组(P<0.05)，Th2计数明显低于对照组(P<0.05)，Th1/Th2比值明显高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 2组患者Th1/Th2变化比较Tab.3 Comparison of Th1/Th2 between two ±s，%)

*P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group before treatment；#P<0.05，与对照组治疗后比较，compared with control group after treatment

2.4 治疗10 d后2组患者血清内毒素浓度水平比较 本研究中，经治疗10 d后，2组患者血清内毒素水平均较治疗前有所降低(P<0.05)，但实验组患者血清内毒素水平明显低于对照组(P<0.05)，见表4。

2.5 2组患者治疗前后脾脏特异性免疫功能情况比较 本研究中，经10d治疗后，实验组患者淋巴细胞增殖、HLA-DR比例明显高于对照组(P<0.05)，caspase-3细胞阳性指数明显低于对照组(P<0.05)，见表5。

表4 2组患者血清内毒素浓度水平变化比较±s)Tab.4 Comparison of endotoxin concentration between two ±s)

*P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group before treatment；#P<0.05，与对照组治疗后比较，compared with control group after treatment

表5 2组患者脾脏特异性免疫功能变化比较±s)Tab.5 Comparison of specific immune-system between two ±s)

*P<0.05，与同组治疗前比较，compared with the same group before treatment；#P<0.05，与对照组治疗后比较，compared with control group after treatment

3 讨论

脓毒症是严重威胁人类生命健康的危重疾病之一，以其高发病率和高死亡率而备受医疗工作者的重视。脓毒症的发病多与感染因素有关，最近高龄化(>65岁)、糖尿病、癌症也被证实与脓毒症的发生具有密切联系，而近年来年龄结构的高龄化、糖尿病、癌症的发病率的升高，可能也是导致脓毒症发病率增高的潜在因素[7]。研究发现[8]，脓毒症患者多会伴有血流动力学异常、免疫系统失调以及脾脏特异性免疫功能异常等病理变化，因此治疗除抗感染外也多偏向于抗休克、调节免疫等。血必净注射液是一种新的中药制剂，方中红花为君以活血化瘀，赤芍、川芎为臣以助君药行血活血，丹参、当归共为佐使以养血活血，全方共奏“凉血活血、祛瘀通络、行气止痛”之功，正符合了王今达教授所提治脓毒症“菌毒并治”的理论[9]。研究发现[10]，血必净注射液具有良好的抗凝血、保护内皮细胞抗内毒素、调节免疫平衡以及改善微循环的作用，临床应用亦取得了较好的疗效。

本研究结果发现，脓毒症患者血流动力学具有较为明显的异常，而血必净注射液可有效纠正脓毒症患者血流动力学的异常。从表2中可以看出，治疗后实验组患者心率明显低于对照组，而MAP、CVP较治疗前明显升高，且优于对照组。研究发现[11]，脓毒症患者血管内皮细胞会释放大量一氧化氮，从而诱导血管扩张导致弥漫性血管扩张型低血压的发生，严重则会导致休克。而本研究实验结果显示，实验组患者在应用血必净注射液后其心率明显降至正常水平，说明感染已经得到一定的控制，MAP、CVP也已回升至正常水平，可见血必净注射液能够有效改善脓毒症患者低血压的情况，且缩血管药物应用降低更进一步证明了其治疗脓毒症低血压的有效作用。

结果发现，血必净注射液能有效提高脓毒症患者Th1水平、降低Th2水平以及改善两者之间的比例。脓毒症患者因感染而导致的免疫系统失调，而Th1、Th2水平的平衡是保持免疫系统正常的主要因素[12]。Th1细胞主要以产生IL-2、IFN-γ、IFN-β等炎性因子为主，以参与细胞免疫、参与细胞和局部炎症有关的免疫应答发挥其作用；Th2细胞主要以产生IL-5、IL-10等为主，以参与体液免疫、刺激B细胞产生抗体发挥其免疫作用。研究证实[13]，Th1细胞产生的细胞因子能抑制Th2细胞的增殖分化，却能促进自身分化成熟；Th2细胞产生的细胞因子亦能抑制Th1细胞的增殖分化，促进自身分化成熟。由此可见，Th1、Th2细胞具有相互抑制的作用，而脓毒症的治疗，必须保证Th1/Th2的平衡。研究发现[14]，重症脓毒症患者Th1水平降低，Th2水平却显著升高，Th1/Th2水平降低，此现象直接增高患者死亡率，而有效降低Th2细胞的水平则会增加患者生存率。以上研究结果从侧面证实了血必净注射液可有效调节Th1/Th2水平，增加脓毒症患者的生存率。

实验得出，血必净注射液具有降低脓毒症患者血清内毒素水平、调节脾脏特异性免疫功能的作用。内毒素(endotoxin)存在于革兰阴性菌细胞壁外膜上的一种脂多糖成分，主要在细菌死亡、裂解时释放，但是却可以通过刺激机体产生大量的炎性介质发生“瀑布样”连锁反应而导致患者大范围的炎症反应以及器官功能的损害，因此有效降低脓毒症患者血清内毒素水平是控制、治疗本病的重点方向。有研究发现[15]，血必净注射液具有直接抗内毒素的作用，在表4中可以看出血必净注射液能有效降低患者血清内毒素水平，与前者的结论一致。亦有文献研究指出[16-17]，脓毒症晚期患者体内脾脏淋巴细胞大量凋亡，而血必净注射液不仅能降低血清内毒素水平，还能有效减少淋巴细胞的凋亡，增加淋巴细胞的增殖，提高免疫水平，这一结论在本研究中也得到了证实，表5显示淋巴细胞增殖明显优于治疗前和对照组。HLA-DR是加工处理抗原微生物的重要分子，还具有抑制免疫细胞间相互作用从而控制免疫应答强度的作用，因此有研究指出要通过调节HLA-DR的表达水平而达到调节免疫平衡的目的[18]。在本研究中，血必净注射液有效提高了HLA-DR的表达水平，这一结果也可能是血必净能有效调整脓毒症患者免疫炎症反应的原因。Caspase-3是天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，具有激活某些特殊的信号系统而达到DNA凋亡的作用，其水平的高低决定凋亡的严重程度[19]。本研究结果显示，血必净注射液能有效降低Caspase-3细胞阳性率，从而证明其能够降低淋巴细胞的凋亡，保证机体正常的免疫调节。

本研究证实了血必净对脓毒症患者具有更好的疗效。因此，对于急性脓毒症患者及时应用血必净注射液进行治疗具有重要意义。在今后研究中，本课题组将对血必净影响脓毒症患者血清内毒素、Th1/Th2水平的实质原因进行深入研究，为本实验所得出的结果做出进一步论证和分析。

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(编校：王俨俨)

Study on effect of Xuebijing injection on Th1/2, endotoxin and immune factors in patients with acute sepsis

FANG Qin1, JIANG Gang-jian2, CHEN Xin2

(1.Department of Intensive Care Unit, The First Affiliated Hospital of Luohe Med & Cal College, Luohe 462000, China; 2.Department of Inspection, The First Affiliated Hospital of Luohe Med & Cal College, Luohe 462000, China)

ObjectiveTo investigate effect of Xuebijing injection on Th1/2, endotoxin and immune factors in patients with acute sepsis.Methods110 cases of sepsis patients were selected and divided into two groups from September 2014 to January 2015.The control group of 55 cases were treated by clinical routine therapy, the experiment group of 55 cases were treated with Xuebijing injection on the basis of control group.Hemodynamics, serum Th1/2, endotoxin and specific immunological function of spleen were compared.ResultsAfter treatment, the heart rate of experiment group was significantly lower than control group (P<0.05), the mean arterial pressure and central venous pressure were higher than control group (P<0.05), vasoconstrictive drugs application amount was less than control group (P<0.05), the ratio of Th1/Th2 was higher than control group (P<0.05), serum endotoxin levels was lower than control group (P<0.05), and the ratio of HLA-DR, lymphocyte proliferation and positive index of caspase-3 cells were lower than control group(P<0.05).ConclusionXuebijing injection can effectively improve haemodynamics in patients with sepsis, regulate serum Th1/Th2 levels, reduce serum endotoxin level and enhance specific immune function of spleen, which has important significance for clinical treatment of sepsis.

Xuebijing injection; sepsis; endotoxin; specific immune function of spleen

方勤，女，硕士，主治医师，研究方向：重症医学，E-mail：fangqinys@126.com。

R278

A

1005-1678(2015)05-0130-04