阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊在抗乙肝病毒治疗过程中的宿主免疫应答研究

张云涛,张四喜,李焱Δ

(1.河北省唐山市传染病医院，河北 唐山 063000；2.吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)



阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊在抗乙肝病毒治疗过程中的宿主免疫应答研究

张云涛1,张四喜2,李焱1Δ

(1.河北省唐山市传染病医院，河北 唐山 063000；2.吉林大学第一医院，吉林 长春 130021)

目的 探讨阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊在治疗慢性乙型肝炎过程中对宿住免疫应答的影响。方法 选择2010年3月～2014年10月在唐山市传染病医院门诊或住院的100名慢性乙型肝炎患者，随机分为阿德福韦酯治疗组及阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊治疗组，每组50例。检测2组患者治疗前后AST、ALT、HBsAg和HBV DNA水平。采用流式技术检测2组患者CD3+CD56+、CD244+NK、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞以及血清中CD4+T相关细胞因子的含量。结果 治疗后各时点2组患者AST、ALT、HBV-DNA水平均较治疗前显著下降(P<0.05)，且治疗3个月、6个月后阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组的AST、ALT水平显著低于阿德福韦酯组(P<0.05)，但2组HBV-DNA相比差异无统计学意义。除治疗后3个月外，2组患者治疗后6、9、12个月的HBsAg水平均较治疗前显著降低(P<0.05)，但2组间比较差异无统计学意义。治疗后6、9、12个月，2组患者外周血中CD3-CD56+NK细胞均较治疗前显著增高(P<0.05)，且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)。治疗后各时点2组患者外周血中的CD244+NK、CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞均较治疗前显著增高(P<0.05)，且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)。但治疗后各时点2组CD3+CD8+T细胞均显著低于治疗前(P<0.05)，2组比较，除治疗后3个月外，其余各时点阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组CD3+CD8+T细胞均较阿德福韦酯组更低(P<0.05)。治疗后2组患者血清中各细胞因子均显著增加(P<0.05)。且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组较阿德福韦酯组各因子水平更高(P<0.05)。结论 阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊治疗慢性乙型肝炎，能显著降低患者AST、ALT、HBV-DNA及HBsAg的情况，促进NK细胞、T/B细胞表达和T细胞分泌细胞因子表达，且效果优于单纯使用阿德福韦酯。

慢性乙型肝炎；阿德福韦酯；扶正化瘀胶囊；NK细胞；T/B细胞；细胞因子

乙型肝炎病毒感染是慢性肝炎的常见致病因素，不仅严重威胁人类的健康，同时消耗巨大的财力。虽然有乙肝疫苗接种的普及，以及干扰素、核苷类似物在临床的广泛应用，但目前临床上不断出现乙肝病毒耐药的报道，使得慢性乙型肝炎的治疗再次陷入僵局。扶正化瘀胶囊是由桃仁、五味子、丹参、发酵虫草菌粉等为主要成分的中药制剂。研究发现其能通过抑制肝星状细胞活化增殖，进而减少细胞外基质过度沉积并促使其降解，以达到减轻肝纤维化的目的[1-2]。同时扶正化瘀胶囊还可抑制纤维连接蛋白对肝星状细胞的活化[3]。目前阿德福韦酯与扶正化瘀胶囊在临床治疗过程当中应用广泛，但并无2者联用对慢性乙肝患者免疫应答情况的相关报道。本实验旨在探讨核苷类似物阿德福韦酯和扶正化瘀胶囊联用对慢性乙型肝炎患者免疫应答情况的影响，以期为临床用药提供免疫学证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年3月～2014年10月在唐山市传染病医院门诊或住院的100名慢性乙型肝炎患者为研究对象。所有入选病例均符合《病毒性肝炎防治方案》(2005)中的诊断标准[4]。排除合并有其他肝炎，慢性心、脑、肾脏疾病的患者及妊娠或哺乳期妇女。其中男性患者67名，平均(48.23±2.67)岁，女性患者33名，平均(50.31±1.71)岁。将100名患者随机均分成2组，每组50例。对照组患者给与阿德福韦酯10 mg，每天1次口服，治疗组在给予阿德福韦酯基础上加用扶正化瘀胶囊1.5g，每天分3次口服。治疗疗程为1年。

1.2 主要试剂及仪器 扶正化瘀胶囊(上海黄海制药厂，国药准字200Z20073)。鼠抗人CD3-FITC、CD244-PE、CD4-PerCP、CD3-PerCP、CD8-PE，Th1/Th2 (IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ)试剂盒(美国R&D公司)；CBA试剂盒(美国BD公司)。

FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)；5702RH台式控温离心机(德国Eppendorf公司)；Abbott I 2000化学发光免疫分析仪(美国Abbott公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 采集所有患者治疗前及治疗后第3、6、9、12个月的外周静脉血10 mL，一部分于4 ℃，1500 r/min离心10 min，分离外周血单核细胞及血清。另一部分用于HBV-DNA、乙肝两对半、ALT、AST等临床指标的检测。

1.3.2 外周血NK细胞检测 在流式管中加入50 μL抗凝血和10 μL荧光素标记的抗体，避光孵育30 min。之后再加入500 μL红细胞裂解液，混匀后避光孵育7 min。PBS洗涤3遍，弃去上清，每管加入200 μL含PBS的单细胞悬液，充分混匀后，上流式检测。

1.3.3 外周血T细胞的检测 参照马亮[5]的方法并稍作修改，进行外周血单个核细胞的分离及细胞计数。在流式管中加入100 μL新鲜分离的PBMC和10 μL特异性荧光素标记的抗体，同型对照管中加入相应的同型抗体，混匀后避光孵育30 min。之后加入2～3 mL PBS，1200 r/min离心10 min，洗涤3次，弃上清，加1%多聚甲醛固定，用流式细胞仪检测。

1.3.4 Th1/Th2细胞因子检测 按照Th1/Th2细胞因子试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 治疗前后2组患者AST、ALT、HBV-DNA及HBsAg的变化 2组患者AST、ALT在治疗3、6、9、12个月均较治疗前均有显著下降(P<0.05)。且治疗3、6个月后阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组的AST、ALT显著低于阿德福韦酯组(P<0.05)。2组患者治疗后各时点HBV-DNA水平均较治疗前显著降低(P<0.05)，但组间比较差异无统计学意义。除治疗后3个月外，2组患者治疗后6、9、12个月HBsAg水平均较治疗前显著降低(P<0.05)，但2组间比较差异无统计学意义。见表1。

表1 治疗前后2组患者AST、ALT、HBV-DNA和HBsAg水平变化Tab.1 Comparison of AST, ALT, HBV DNA and HBsAg levels pre- and post-treatment between two ±s,n=50)

*P<0.05，与同组治疗前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，与同时点阿德福韦酯组相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.2 治疗前后2组患者外周血中NK细胞变化比较 流式结果显示：与治疗前相比，2组患者治疗6、9、12个月后外周血中CD3-CD56+NK细胞比例显著增高(P<0.05)，且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组患者外周血中CD3-CD56+NK细胞显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)。2组患者治疗后各时点CD244+NK细胞比例均较治疗前显著增高(P<0.05)，且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组水平显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)。见图1、表2。

图1 2组患者外周血中CD3-CD56+NK及CD244+NK细胞水平变化Fig.1 Changes of CD3-CD56+NK cell and CD244 + NK cell ratio in peripheral blood of two groups

组别时间CD3-CD56+NKCells(105/mL)CD244+NKCells(104/mL)阿德福韦酯组治疗前0.98±0.171.04±0.21第3个月1.19±0.261.26±0.18*第6个月1.72±0.44*1.52±0.46*第9个月1.90±0.71*1.81±0.47*第12个月2.31±0.81*2.36±0.66*阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组治疗前1.16±0.231.17±0.19第3个月1.23±0.211.33±0.20*#第6个月1.86±0.51*#1.67±0.51*#第9个月2.15±0.64*#2.24±0.53*#第12个月2.42±0.73*#2.68±0.74*#

*P<0.05，与同组治疗前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，与同时点阿德福韦酯组相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.3 外周血T细胞的检测 流式结果显示：治疗后各时点2组患者外周血中的CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞均显著增高(P<0.05)，且阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)。治疗后各时点2组患者外周血中CD3+CD8+T细胞均显著降低(P<0.05)。组间相比，除治疗后3个月外，其余时间点阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组均低于阿德福韦酯组(P<0.05)，见图2、表3。

图2 2组患者外周血T细胞水平变化Fig.2 Changes of T cells in peripheral blood between two groups

组别时间TotalCD3+TCells(105/mL)CD3+CD4+TCells(105/mL)CD3+CD8+TCells(105/mL)阿德福韦酯组治疗前6.68±1.234.26±0.985.87±0.97第3个月7.35±1.62*5.89±1.32*5.11±0.84*第6个月8.86±1.78*6.14±1.40*4.73±0.79*第9个月9.77±1.65*7.88±1.62*3.64±0.51*第12个月9.62±1.74*8.25±1.75*3.58±0.53*阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组治疗前6.84±1.354.37±0.925.90±1.01第3个月8.24±1.97*#6.04±1.21*#5.06±0.73*第6个月9.01±2.06*#6.42±1.54*#4.56±0.82*#第9个月9.83±1.76*#7.93±1.73*#3.29±0.49*#第12个月10.32±1.61*#9.47±1.86*#3.17±0.40*#

*P<0.05，与同组治疗前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，与同时点阿德福韦酯组相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.4 2组患者Th1/Th2型细胞因子的动态变化 流式蛋白定量结果显示：治疗前，阿德福韦酯组IL2-CD4+T、IFN-γ+CD4+T、TNF-α+CD4+T、IL-4+CD4+T、IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T为10.75±1.64、8.23±1.04、7.86±0.76、3.75±0.39、2.08±0.42、2.49±0.51，均随时间的变化逐渐增加(P<0.05)，最高到第12个月时分别为25.08±3.37、19.14±4.13、18.87±3.21、14.45±2.89、13.26±2.64、9.72±1.72；阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组上述指标在治疗前分别为11.89±1.85、9.63±1.22、8.35±0.83、3.41±0.22、2.11±0.56、2.63±0.59，均随时间的变化逐渐增加(P<0.05)，最高到第12个月时分别为26.94±3.06、19.58±3.81、19.94±3.53、15.67±3.22、14.45±2.70、10.23±1.26。治疗后阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组患者各细胞因子水平显著高于阿德福韦酯组(P<0.05)，见图3。

图3 2组患者血清中Th1/Th2细胞因子水平变化*P<0.05，治疗后与治疗前相比；#P<0.05，阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组与阿德福韦酯相比Fig.3 Changes of serum Th1/Th2 cytokine levels of two group*P<0.05,comparison between pre-treatment and post-treatment;#P<0.05,comparison between Adefovir ester joint Fuzheng Huayu group and Adefovir ester group

3 讨论

慢性乙型病毒性肝炎是一种全球性的传染病，由于病毒的持续复制导致肝脏组织的进行性损伤，最终导致肝硬化、肝癌，严重影响患者的生存质量。所以抑制乙肝病毒的治疗尤为重要[6-8]。核苷类似物能够有效的抑制乙肝病毒复制，成为治疗乙型肝炎病毒感染的首选。其中的代表药物阿德福韦酯能在肝脏中转化为具有活性的二磷酸阿德福韦，从而抑制乙肝病毒的复制。目前已有临床研究证实阿德福韦酯在治疗过程中的变异率显著低于其他的核苷类似物[9]。故在临床上广泛使用。

研究显示扶正化瘀胶囊可以有效促进二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠肝细胞的修复，降低CCl4造成的急性肝损伤大鼠的血清转氨酶，提高肝组织超氧化物歧化酶的活性，降低肝脏丙二醛的含量，进而抑制脂质过氧化作用[10-11]。相应的肝组织病理学结果也显示肝脏损伤显著减轻，肝细胞呈轻度水样变，脂肪变性较轻，仅见少数肝细胞呈脂肪变，个别呈气球样变，未见显著的肝细胞坏死及炎细胞浸润，偶见轻度纤维组织增生，汇管区扩大不显著。而且，血清ALT、AST水平显著降低。提示扶正化瘀胶囊能通过抑制肝脏脂质过氧化反应，调节肝内脂肪代谢，从而改善肝细胞炎症反应，延缓或阻止纤维化的发生或进展，在抗肝损伤方面发挥了极其重要的作用。Cho H[12]发现肝脏组织中存在大量NK细胞，可抑制病毒的复制，这一方面决定于其分泌细胞因子的能力，另一方面还取决于其表面受体的表达情况及活化形式。慢性乙肝患者外周循环中的NK细胞表达显著减少，NK细胞的表面能够表达CD244，它是淋巴细胞活化分子家族受体的成员，激活后可以促进IFN-γ大量分泌，乙肝患者中CD244的表达是受抑制的。

本实验结果显示：阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊联合治疗慢性乙肝，患者肝脏酶学显著下降，且治疗3个月、6个月后阿德福韦酯+扶正化瘀胶囊组的AST、ALT显著低于阿德福韦酯组(P<0.05)。但HBV-DNA、HBsAg的变化2组差异并无统计学意义。同时阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊能够显著增加CD244 NK细胞的比例，有利于抑制病毒复制。HBV病毒的持续复制能够招募大量的CD8+T细胞清除病毒，但同时会导致CD4/CD8 T细胞比例失调，而Th1/Th2释放的细胞因子能够调节CD4/CD8 T细胞比例。本实验结果显示经阿德福韦酯或阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊治疗后，患者血清中细胞因子均较治疗前显著增加(P<0.05)。且阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊较单纯使用阿德福韦酯增加更为显著(P<0.05)。这与金剑等[13]的研究结果相吻合，为阿德福韦酯联合扶正化瘀胶囊在抗乙肝病毒治疗过程中的宿主免疫应答研究提供了积极的参考依据。

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(编校：吴茜)

Reseach on host immune response in patients with chronic hepatitis B during antiviral treatment with Adefovir ester and Fuzheng Huayu

ZHANG Yun-tao1, ZHANG Si-xi2, LI Yan1Δ

(1.Tangshan Contagious Hospital, Tangshan 063000, China; 2.The First Hospital of Jilin Univeristy, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate the immune response of Adefovir ester combine the Fuzheng Huayu in the process of the treatment of chronic hepatitis B.Methods100 cases with CHB from March 2010 to October 2014 collected in outpatients clinic or hospital were randomly divided into Adefovir ester treatment group and Adefovir ester joint the Fuzheng Huayu treatment group.Levels of AST, ALT, HBsAg and HBV DNA pre-and-post treatment were detected.CD3-CD56+，CD244+NK，CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T cells and the contents of CD 4+T cells in serum of two groups were measured by flow cytometry analysis.ResultsThe levels of AST、ALT、HBV-DNA of two group post-treatment were all significantly lower than pre-treatment(P<0.05),and the level of AST and ALT in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group at 3 months and 6 months were obviously lower than Adefovir ester treatment group.HBV-DNA contents between two groups had no significant difference.HbsAg levels of two groups were all significantly increased after 6,9,12 months’treatment (P<0.05),While there was no significant difference between two groups post-treatment.CD3-CD56+cell at 6,9,12 months in two groups were all higher than pre-treatment(P<0.05), which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group were more higher than Adefovir ester treatment group(P<0.05).CD244+NK,CD3+T cell, CD3+CD4+Tcell at each point post-treatment in peripheral blood of two groups were all increased significantly(P<0.05),which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group increased more obviously than Adefovir ester treatment group (P<0.05).However, CD3+CD8+cells were reduced obviously after treatment in two groups(P<0.05), which besides 3 month point, its ratio in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group decreased more significantly than Adefovir ester treatment group at other points(P<0.05).Cytokines in serum of two groups were all increased significantly post-treatment(P<0.05), which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group were more lower (P<0.05).ConclusionAdefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment can improve the situation of AST, ALT, HBV DNA and HBsAg in patients with chronic hepatitis B,promote the expression of NK cells,T cells and Tcell secrited cytokines，and the efficacy is better than Adefovir estertreatment alone.

Chronic hepatitis B; adefovir ester; Fuzhengh Huayu; NK cells; T cells; cytokines

张云涛，女，硕士，副主任医师，研究方向：传染病临床研究，E-mail：15612548855@163.com；李焱，通讯作者，女，硕士，副主任医师，研究方向：丙型肝炎合并代谢综合征的临床分析，E-mail：18331538083@163.com。

R575.2

A

1005-1678(2015)06-0048-05