根皮素诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的机制研究

王会，吴汉东，刘政

(辽宁医学院 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121001)



根皮素诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡的机制研究

王会，吴汉东，刘政

(辽宁医学院 食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121001)

目的 研究根皮素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响，并探讨其机制。方法 以30、60、120 mg/L根皮素培养对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721分别为低、中、高浓度处理组；应用相差显微镜观察凋亡细胞形态学变化，AO/EB双荧光染色法观察经根皮素处理的细胞形态；应用流式细胞仪检测细胞凋亡率、细胞周期、线粒体膜电位、钙离子稳态的变化。结果 细胞呈典型的凋亡形态学变化；根皮素对SMMC-7721细胞有诱导凋亡作用且呈浓度和时间依赖性；细胞周期阻滞于G1期，细胞线粒体膜电位降低，细胞内钙离子浓度增大。结论 根皮素可通过影响细胞周期，降低线粒体膜电位，改变细胞内钙离子平衡来诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡。

根皮素；肝癌细胞SMMC-7721；凋亡

肝癌是全球第五位常见恶性肿瘤，病死率位于第三位。全世界40%左右的肝癌患者集中在中国[1]。目前，由于绝大多数抗肿瘤药物较大的不良反应，限制了其疗效发挥和广泛应用[2]。因此，寻找低毒、安全有效、靶点明确的天然抗肿瘤药物成为科学界研究的焦点。

根皮素是一种存在于苹果、梨等水果和多种蔬菜根茎或根皮中的类黄酮物质，具有抗菌、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤以及雌激素样作用等活性。根皮素能激活蜂窝蛋白激酶，对细胞无序增殖有抑制作用，可用于多种肿瘤的治疗[3-4]。根皮素可诱导肠癌细胞凋亡[5]。根皮素可通过抑制糖的跨膜运输来诱导 B16 小鼠肿瘤 4A5 细胞凋亡[6]，还可以干扰 B16 肿瘤细胞 DNA 的复制，影响 PKC 的活性，从而促进细胞凋亡[7]。但目前关于根皮素诱导肝癌细胞凋亡的研究还很少，本实验以人肝癌细胞 SMMC-7721为研究对象，探讨了根皮素对其凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:人肝癌 SMMC-7721细胞株(购自协和医科大学)。

1.1.2 药品与试剂：根皮素(纯度，99.99%；批号：P7912-100MG)、甲基噻唑蓝(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、溴乙啶(EB)，二甲基亚砜(DMSO)(购自Sigma 公司)；DMEM培养基和胎牛血清(均购自GIBCO 公司)；Annexin V-FITC Apoptosis Detection试剂盒，JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(购自BD公司)。

1.1.3 主要仪器 FC500流式细胞仪(BECKMAN，美国)；TE2000-E激光共聚焦显微镜(Nikon，日本)；细胞培养箱(Heraeus，德国)；IX-71倒置相差显微镜(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%标准胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养细胞，当培养液颜色变黄时更换培养液，当细胞达到70%～80% 融合度时细胞传代。

1.2.2 药物配制及细胞分组处理 根皮素用DMSO(终浓度≤0.05%)溶解，再用基础培养基稀释成浓度为8 mg/mL的母液，分装，置-20 ℃ 冰箱避光保存备用。取对数生长期细胞，分别换用含有30、60、120 mg/L根皮素的培养液培养至预定时间，记为低、中、高浓度处理组。

1.2.3 细胞形态学观察 取对数生长期形态比较规则的细胞，浓度为4.0×105个/孔接种于6孔板，每孔2 mL细胞悬液，孵育12 h，待细胞贴壁融合后，每孔换用含有不同浓度根皮素的培养液处理24 h，并设对照组(用DMSO处理，终浓度≤0.05%)。在倒置相差显微镜下观察其形态并拍照。

1.2.4 AO/EB复染 6孔板每孔换用含有不同浓度根皮素的培养液处理24 h，并设对照组，然后将培养液弃去，换入新的培养液，每孔2 mL，并将细胞吹打混匀，制成细胞悬液，每孔加入AO、EB各6 μL，并混匀，常温避光孵育5 min，在共聚焦显微镜下观察其形态并拍照。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI双标记法检测凋亡率

Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析凋亡率：收集对照组和处理组细胞，(1～5)×105细胞/样品，每个样加入100 μL的PBS悬浮细胞，同时加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混匀。室温避光孵育7～12 min，400目筛网过滤，流式细胞仪定量检测。实验重复3次。

细胞周期检测：收集对照组和处理组细胞，调整细胞浓度为(1～5)×105个/样品，于4 ℃，70% 无水乙醇中孵育12 h。离心去乙醇，PBS漂洗，加入0.5 mL PI染液，4 ℃避光孵育20 min。流式细胞仪上机检测。实验重复3次。

线粒体膜电位检测：收集对照组和处理组细胞，1.0×106个/样品，加入0.5 mL JC-1染色液，在CO2培养箱避光孵育12 min，用预热的PBS洗涤，每个样品加入0.5 mL PBS。过滤，流式细胞仪上机检测。实验重复3次。

细胞内钙离子浓度的测定：收集对照组和处理组细胞，调整细胞浓度至 (1～2)×106个/ mL。加入Fluo-3/Am至终浓度为8～10 μM，于5% CO2、37 ℃，避光孵育20～40 min，摇匀，并设置阴性对照 (不加Fluo-3/Am)。离心，去掉多余染料，用无钙PBS洗涤2次，然后用无钙PBS重悬至0.5 mL，流式细胞仪上机检测。实验重复3次。

2 结果

2.1 细胞形态学观察结果 对照组细胞贴壁生长，排列紧密，细胞立体性好，胞浆饱满。根皮素处理24 h后，低浓度处理组(30 mg/L)细胞萎缩，胞体缩小，并有碎片；中浓度处理组(60 mg/L)细胞形态变的模糊不清，凋亡细胞与邻近细胞脱离；高浓度处理组(120 mg/L)细胞裂解成小的碎片，细胞膜皱缩，胞体缩小，细胞形态发生重大变化，出现细胞坏死，见图1。

图1 根皮素作用SMMC-7721细胞24 h细胞形态(×40)Fig.1 Morphology of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin(×40)

2.2 AO/EB复染结果 根据AO，EB染料性质的不同，可见早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞。早期凋亡细胞的胞膜通透性较低，溴乙锭不易进入细胞内部，细胞呈淡黄色，核染色质呈圆珠状或固缩状；晚期凋亡的细胞胞膜通透性增大，但未破裂，细胞呈橘红色，染色浓一些，有些晚期凋亡的细胞已接近坏死，见图2。

图2 根皮素作用SMMC-7721细胞24 h后细胞形态(AO/EB复染，×40)Fig.2 Morphology of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin(AO/EB counterstain，×40)

2.3 Annexin V-FITC/PI双标记法检测凋亡率结果 Annexin V-FITC/PI双标记结合流式细胞术法能够定量分析细胞凋亡，并可定量分析早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、活细胞和坏死细胞。(12、36、48 h凋亡率数据未提供)，随着根皮素作用时间的延长和浓度的增大，促凋亡效果越显著，呈现浓度依赖性和时间依赖性，见图3。

图3 根皮素作用SMMC-7721细胞凋亡率(n=3)**P<0.01，与对照组相比Fig.3 Apoptosis rate of SMMC-7721 after treatment by phloretin(n=3)**P<0.01，compared with control group

2.4 细胞周期的检测结果 随着根皮素浓度的增大，与对照组相比,G1期细胞数百分比增大(P<0.05)，S期细胞百分比下降(P<0.01)，G2期细胞百分比下降(P<0.05)，表明细胞经根皮素处理后增殖停滞在G1期，DNA合成受到阻，这种关系随着根皮素剂量的增大越明显，呈现显著的剂量依赖性。见表1。

组别细胞周期G1(%)S(%)G2(%)对照组53.38±7.3136.83±3.629.8±2.64低浓度处理组(30mg/L)66.49±8.0125.35±2.89**7.95±1.60中浓度处理组(60mg/L)73.77±9.04*13.18±3.76**9.04±2.98高浓度处理组(120mg/L)74.82±9.89*17.18±4.78**6.00±2.04

*P<0.05，**P<0.01，与对照组比较，compared with control group

2.5 细胞线粒体膜电位的检测结果与对照组比较 各处理组SMMC-7721细胞线粒体膜电位均显著下降(P<0.01)。见图4。

图4 根皮素作用SMMC-7721细胞24 h的线粒体膜电位变化图**P<0.01，与对照组相比Fig.4 Mitochondrial membrane potential of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01,compared with control group

2.6 细胞内钙离子浓度的测定结果 与对照组比较，各浓度处理组SMMC-7721细胞内Ca2+浓度均显著增大(P<0.01)。见图5。

图5 根皮素作用SMMC-7721细胞24 h后Ca 2+浓度变化**P<0.01，与对照组相比Fig.5 Concentrations of intracellular calcium of SMMC-7721 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01，compared with control group

3 讨论

根皮素是一种类黄酮化合物，是一种具有治疗肿瘤潜能的天然化合物，根皮素可抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡[8]。根皮素可通过干扰Ⅱ型葡萄糖转运蛋白来诱导肝癌细胞凋亡[9]。根皮素能够以线粒体途径诱导BEL-7402细胞凋亡，且呈现浓度依赖性；能够干预肝癌细胞粘附、运动及侵袭能力，从而抑制肿瘤细胞转移[10-11]。

根皮素为芳香环结构，可插入到DNA双螺旋分子中，从而阻止 DNA合成，影响细胞周期的分布，使细胞发生凋亡。通过检测根皮素作用后细胞周期的分布情况，发现细胞发生了G1期阻滞，G2期细胞减少，进入M期的细胞数量减少，进而抑制了细胞增殖。这为今后开展根皮素诱导肝癌细胞凋亡机理的研究提供了重要实验依据。

线粒体与细胞凋亡过程中的许多重要事件密切相关[12]，发挥着重要作用，线粒体膜电位下降，膜通透性转运孔开放，通透性增加，致使线粒体内的细胞色素C，凋亡诱导因子AIF等进入细胞质，启动凋亡程序[13]。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的标志性事件。根皮素是一种解偶联试剂，可以抑制线粒体的氧化磷酸化作用[14]，ATP 合成受阻，能量缺乏，促使细胞凋亡。本研究采用 JC-1标记结合流式细胞仪检测线粒体膜电位变化，发现经根皮素作用后的SMMC-7721细胞的线粒体膜电位降低。由此可以推测SMMC-7721细胞在经根皮素作用后有线粒体膜电位的变化。

在正常细胞中Ca2+主要与蛋白质结合封存在内质网和线粒体中，游离的Ca2+很少，只是在受到外界刺激时才被释放出来充当信号分子。几乎所有细胞的反应，从收缩、胞吐到基因表达、细胞凋亡都被细胞质内局部或全部游离Ca2+浓度的变化控制。有研究表明游离 Ca2+在细胞内的过度积累可以直接导致细胞凋亡的发生[15]。当根皮素诱导SMMC-7721细胞凋亡时，细胞质内游离钙离子浓度升高，Ca2+稳态发生变化，表明适当浓度的根皮素有较好的诱导 SMMC-7721 细胞凋亡的效果。钙信号可能是通过线粒体钙超载和钙依赖的酶这2种方式来控制凋亡的。

综上所述，根皮素是通过抑制细胞 DNA 合成，降低线粒体膜和干扰钙离子稳态来诱导 SMMC-7721 细胞凋亡的。根皮素诱导肝癌细胞凋亡及其机制有待从相关基因及蛋白方面进一步研究。

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(编校：王冬梅)

Mechanism of phloretin induced the apoptosis of hepatoma carcinoma cell SMMC-7721

WANG Hui, WU Han-dong, LIU Zheng

(College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate effect of phloretin on apoptotic of hepatoma carcinoma cells SMMC-7721,and explore its mechanisms.MethodsLogarithmic phase of hepatoma carcinoma cells SMMC-7721 were cultured separately with 30, 60, 120 mg/L phloretin, morphological alterations of apoptotic were observed by phase contrast microscopy and AO/EB double fluorescence staining method was used to observe were low，medium and high concentration trentment group,respectively.the cells treated by phloretin.Apoptotic rates, cell cycle progression, mitochondrial trans-membrane potential and intracellular calcium homeostasis were detected by flow cytometry.ResultsCells appeared typical apoptosis morphological alterations.Phloretin induced SMMC-7721 cell line apoptosis in a dosage and duration dependent manner.Cell cycle was arrested at G1 phase, mitochondrial trans-membrane potential decreased, intracellular free Ca2+increased.ConclusionPhloretin induce apoptosis of SMMC-7721 by affecting cell cycle progression, reducing mitochondrial trans-membrane potential and changing intracellular calcium homeostasis.

phloretin; human hepatoma cells SMMC-7721; apoptosis

王会，男，博士，讲师，研究方向：细胞凋亡，E-mail：yxlwhx077@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)06-0025-04