小分子抑制剂LDYS-14007对JAK1-STAT3信号通路的影响研究

纪前前，郭尚敬

(聊城大学 药学院，山东 聊城 252000)



小分子抑制剂LDYS-14007对JAK1-STAT3信号通路的影响研究

纪前前，郭尚敬Δ

(聊城大学 药学院，山东 聊城 252000)

目的 研究LDYS-14007对JAK1-STAT3信号通路的影响。方法 分别用10 μmol 、1 nmol 的LDYS-14007和10 μmol 的Tofacitinib处理MDA-MB-231细胞。用Western blot法检测JAK1和STAT3的蛋白表达以及磷酸化状况。结果 吸光度A与蛋白质浓度C呈线性相关, 线性方程为A=0.0075C+0.0029，r= 0.9976，线性范围为1.08～5.08 mg/mL；随着LDYS-14007浓度的增加，Phospho-JAK1，Phospho-STAT3的量逐渐减少。结论 LDYS-14007可通过降低JAK1和STAT3的磷酸化水平抑制JAK1-STAT3信号通路。LDYS-14007可能在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)的治疗中起重要作用。

LDYS-14007；JAK-STAT信号通路；类风湿性关节炎

Janus激酶/信号传导及转录激活因子(Janus-activated kinase signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)是近年来新发现的一条与炎症细胞因子、肿瘤密切相关的细胞信号传导通路[1]。Janus激酶(Janus-activated kinase，JAK)是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶。有4个家族成员，分别是JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。前3者广泛存在于各种组织和细胞中，而JAK3仅存在于骨髓和淋巴系统[1]。许多细胞因子与受体结合后，受体发生二聚化而激活，募集或连接胞内JAK酪氨酸蛋白激酶，JAK激酶被募集到受体后形成同源或异源二聚体，从而激活下游信号通路[2]。研究表明[3]，不同的细胞因子受体募集不同的JAK激酶，具有βc亚基的受体主要募集JAK2并形成同源二聚体；具有gp130亚基的受体和II型细胞因子受体可以募集JAK1、JAK2和TYK2并形成异源二聚体；而JAK3只被具有γc亚基的受体募集并激活，通常与JAK1形成二聚体。

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)是一种以持续性滑膜炎和多关节进行性骨破坏为特点的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明了。主要表现为进行性侵蚀性关节炎及晨僵，部分患者可出现发热、贫血、皮下结节及淋巴结肿大等关节外表现。人群发病率为0.5%～1.0%[4]。目前用于治疗RA的药物主要有非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药和糖皮质激素。临床一、二线用药的主导是改善病情抗风湿药甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)和生物类改善病情抗风湿药依那西普(etanercept，Enbrel)以及2者的联用[5]。RA患者免疫紊乱主要由肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors-α，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)等细胞因子介导[6]。细胞因子与受体结合后，受体发生二聚化而激活，募集或连接胞内JAK酪氨酸蛋白激酶，JAK激酶被募集到受体后形成同源或异源二聚体，从而激活下游信号通路[2]。其中JAK1，STAT3分子与RA的发生密切相关。因此，JAK1-STAT3信号通路成为治疗RA的潜在靶点[5]。

近期，本研究筛选发现一种新的吡咯并嘧啶类可阻断上述细胞因子的级联放大作用，从而改善RA患者受损关节症状—JAK1 抑制剂LDYS-14007，本文旨在探讨LDYS-14007的分子作用机理，研究其在RA治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞 MDA-MB-231细胞(购自美国模式菌种收藏所，ATCC)。

1.2 药品与试剂 LDYS-14007由本实验室筛选所得；Tofacitinib(购自Axon Biochemicals，CPS115, Postbus, Netherlands)；一抗anti-JAK1，anti-Phospho-JAK1，anti-STAT3(购自 Cell Signaling Technology，批号分别为#3332、#3331-s、#9139-s)；anti-Phospho-STAT3(购自epitomics，批号为#2236-1)。Tris-base、甘氨酸、SDS、丽春红S、BSA、胰蛋白酶、Anti-β-actin、兔源的二抗(购自北京鼎国科技技术有限公司)；ECL(购自Pierce Inc，USA)；IL-6(购自 Sigma 公司)；胎牛血清，DMEM培养液，PBS(购自Gibco公司)；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 仪器 二氧化碳细胞培养箱(Thermo，USA)；全自动酶标仪(Biotek，USA)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司，中国)；电泳系统(Bio-Rad，USA)；倒置相差显微镜(OLYMPUS，JAPAN)。

1.4 细胞培养 参照刘文哲等[7]介绍的方法复苏MDA-MB-231细胞，采用含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养。放在37 ℃、CO2细胞培养箱中培养。用倒置相差显微镜观察细胞，至细胞长满培养皿，即可传代。在无菌操作台中，用吸管吸去旧培养液，加入3 mL PBS液洗2～3次，小心吸取PBS液，换用新的无菌吸管吸取胰蛋白酶液2 mL进行消化，在37 ℃培养箱静置约2 min，用吸管轻轻吹打细胞，使其脱离形成单细胞悬液，用细胞计数板在显微镜下计数，取实验所需细胞数分皿，并置于CO2细胞培养箱中无菌培养。每3～4天传代一次，实验时取对数生长期细胞。

1.5 LDYS-14007或Tofacitinib作用于MDA-MB-231时的蛋白提取与浓度测定 MDA-MB-231细胞接种于 24 孔板。待贴壁后，用10 μmol的Tofacitinib，以及1 nmol,10 μmoL的LDYS-14007分别处理1h，加3 μL IL-6处理10 min。PBS洗1次，然后用2×SDS Loading Buffer(1M Tris-HCL 6.25 mL，SDS 2 g，溴酚蓝5 mg，甘油10 mL，β-巯基乙醇5 mL，加水定容至50 mL)裂解，收集于Eppendorf管中，煮沸10 min。采用全自动酶标仪对细胞裂解提取物进行总蛋白浓度测定, 作出蛋白浓度-吸光度工作曲线, 然后分别检测每份提取物在 490 nm波长下的吸光度A值, 继而得出每份细胞裂解提取物的总蛋白浓度。实验重复3次。

1.6 Western blot检测JAK1和STAT3的蛋白表达以及磷酸化 等量的样品用 SDS-PAGE 胶(其中浓缩胶为 5%，分离胶为 8%)，在 Tris-甘氨酸电泳缓冲液(每升含 Tris-base 3.2 g, 甘氨酸 18.8 g, SDS 1 g)中90～120 V电泳，待目的条带跑至胶的 1/2～2/3处停止电泳。用半干法将蛋白从PAGE胶转移至硝酸纤维素滤膜，其中1 L转移缓冲液含甘氨酸2.9 g(39 mM),Tris-base 5.8 g(48 mM)，SDS 0.37 g，以及20%甲醇。转膜电流8 mA/cm2, 转膜时间约40 min。转膜结束后，用丽春红S染色液染色 5～10 min。根据染色结果确定蛋白转移情况和蛋白条带在硝酸纤维素滤膜上的相对位置。然后用含5%BSA的TBST溶液[20 mM Tris-HCl(pH 7.2～7.4)，150 mM NaCl， 0.1 %Tween-20]在脱色摇床上室温封闭1 h，然后加入特异性一抗(1:3000稀释)，4 ℃孵育过夜。TBST 室温洗涤3次， 每次5 min。 加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:5000稀释)， 置于摇床上室温孵育 1 h。TBST溶液洗涤2次，每次 5 min。最后加适量 ECL发光剂，用X胶片曝光、显影、定影、拍照。

2 结果

2.1 蛋白质定量工作曲线 吸光度(A)与蛋白质浓度(C)呈线性相关, 线性方程为A=0.0075C+0.0029,r=0.9976,线性范围为1.08～5.08 mg/mL。该测定方法较为可靠。见图1。

图1 蛋白定量曲线Fig.1 The protein quantitative curve

2.2 LDYS-14007抑制MDA-MB-231细胞中JAK1 Tyr1022的磷酸化 用浓度为1 nmol、10 μmol的LDYS-14007以及浓度为10 μmol的Tofacitinib分别处理细胞，随着LDYS-14007浓度的增加，Phospho-JAK1的量逐渐减少，表明LDYS-14007可以抑制JAK1的磷酸化，进而抑制JAK-STAT信号通路的激活。见图2。

图2 LDYS-14007对MDA-MB-231细胞Phospho-JAK1表达的影响(n=3)A：Phospho-JAK1的Western blot图；B：Phospho-JAK1/β-actin的蛋白灰度比图*P<0.05，与IL-6组相比Fig.2 Effect of LDYS-14007 on Phospho-JAK1 expression in MDA-MB-231 cell(n=3)A:Western blot of Phospho-JAK1;B: Protein gray ratio of Phospho-JAK1/β-actin*P<0.05，compared with IL-6 group

2.3 LDYS-14007抑制MDA-MB-231细胞中STAT3 Tyr705的磷酸化 用浓度为1 nmol、10 μmol的LDYS-14007以及浓度为10 μmol的Tofacitinib分别处理细胞，随着LDYS-14007浓度的增加，Phospho-STAT3的量逐渐减少，表明LDYS-14007可以抑制STAT3的磷酸化，进而抑制JAK-STAT信号通路的激活。见图3。

图3 LDYS-14007对MDA-MB-231细胞Phospho-STAT3表达的影响(n=3)A：Phospho-JAK1的Western blot图；B: Phospho-STAT3/β-actin的蛋白灰度比图*P<0.05,与IL-6组相比Fig.3 Effect of LDYS-14007 on Phospho-STAT3 expression in MDA-MB-231 cells(n=3)A:Western blot of Phospho-STAT3;B: Protein gray ratio of Phospho-STAT3/β-actin*P<0.05,compared with IL-6 group

3 讨论

目前，国内外治疗RA的药物包括非甾体类抗炎药、镇痛药、改善病情抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、植物药等[8]。传统RA的治疗模式有金字塔、倒金字塔、上台阶、下台阶等，随着生物制剂的发展，RA的治疗模式也有了改变。欧洲风湿病防治联合会和国际指导委员会都发表了RA治疗指南和原则[9]，应用药物仍然是以改善病情抗风湿药为主，非甾体抗炎药和糖皮质激素则用于辅助治疗。强调早期使用改善病情抗风湿药、甲氨蝶呤应作为类风湿关节炎治疗的基础用药。如最初改善病情抗风湿药方案治疗未能达标，当存在预后不良因素时应考虑加用生物制剂，且应从TNF-α抑制剂开始，并与甲氨蝶呤联合使用。目前TNF-α抑制剂与甲氨蝶呤单用或联用占一、二线临床RA用药的70%～80%[1]。但尚无证据表明这些药物的治疗能中止RA中软骨、骨及软组织的破坏进程，且这些药物需长期服用，毒性大、患者依从性差。

研究表明[10]，选择特异性阻断JAK-STAT信号通路是一个切实有效的RA治疗途径。而深入研究JAK-STAT信号转导途径在RA所致滑膜细胞增殖、炎性介质分泌及关节破坏中的作用，有助于深入了解RA的发病机制，并为研制出更高效、安全、经济的RA新药提供理论依据。

LDYS-14007是吡咯并嘧啶类小分子抑制剂，可以阻断JAK-STAT信号通路，抑制炎症趋化因子的表达，进而改善RA的病情。与单抗药物相比，具有分子量小，价格低廉，应用方便等优点，应用前景相当广阔。本实验室下一步的工作计划是研究LDYS-14007对炎症趋化因子基因表达的影响，以及对模型动物类风湿炎症的改善情况。

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(编校：王冬梅)

Study on the effect of small molecule inhibitors LDYS-14007 on JAK1- STAT3 signaling pathway

JI Qian-qian, GUO Shang-jingΔ

(College of Pharmacy, Liaocheng University, Liaocheng 252000, China)

ObjectiveTo study the effect of LDYS-14007 on JAK1-STAT3 signaling pathways.MethodsMDA-MB-231 cells were treated with 10 μmol,1 nmol LDYS-14007, and 10 μmol Tofacitinib,respectively.Western blot assay was used to determine the expression of JAK1,Phospho-JAK1,STAT3 and Phospho-STAT3.ResultsThe absorbance value was linearly related to the concentration of protein C， The linear equation is A=0.0075C+0.0029,r= 0.9976, The linear range of 1.08-5.08 mg/mL, With the increased concentration of LDYS-14007, the amount of Phospho-JAK1, Phospho-STAT3 were all gradually decreased.ConclusionLDYS-14007 leads to the levels of Phospho-JAK1 and Phospho-STAT3 decrease, which inhibits JAK1-STAT3 signaling pathway.LDYS-14007 may play an important role in the treatment of rheumatoid arthritis.

LDYS-14007; JAK1- STAT3 signaling pathways; rheumatoid arthritis

国家高新技术研究发展计划(863计划，2012AA02A306)

纪前前，女，硕士在读，研究方向：JAK小分子抑制剂，E-mail：929672413@qq.com；郭尚敬，通讯作者，男，博士，教授，研究方向：基因工程药物，植物生物反应器，E-mail：guoshangjing@163.com。

R9

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1005-1678(2015)06-0010-03