甲氨蝶呤联合复方风湿宁对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞Treg/Th17免疫平衡的影响

李晓佳，赵迎杰，孙广臣

(1.桂林医学院 免疫学教研室，广西 桂林 541000；2.山西医科大学第二临床医院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林医学院 药学院，广西 桂林 541000)



甲氨蝶呤联合复方风湿宁对类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞Treg/Th17免疫平衡的影响

李晓佳1，赵迎杰2，孙广臣3Δ

(1.桂林医学院 免疫学教研室，广西 桂林 541000；2.山西医科大学第二临床医院 骨科，山西 太原 030001；3.桂林医学院 药学院，广西 桂林 541000)

目的 研究复方风湿宁(compound Fengshining，FSN)联合甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)对类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)Treg/Th17免疫平衡的影响。方法 体外培养RA FLS，分别用FSN和MTX处理，分为FSN 1、2、3组(0.01、0.1、1.0 mg/mL FSN)，MTX 1、2、3组(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，联合1、2、3组(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加药的培养基作为对照组，共10组。采用MTT法检测各组RA FLS增殖情况，Real-time PCR法检测各组IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt mRNA表达，ELISA检测各组IL-10、IL-17、IL-22水平。结果 FSN各组、MTX各组和联合各组FLS增殖OD值均低于对照组，尤以联合2组降低最显著(P<0.05)。FSN2组、MTX2组和联合2组IL-10 mRNA、Foxp3 mRNA表达均高于对照组，ROR-γt mRNA表达低于对照组，尤以联合2组变化显著(P<0.05)。FSN2组和联合2组IL-17mRNA表达均低于对照组，以联合2组降低显著(P<0.05)。FSN2组、MTX2组和联合2组IL-10水平均高于对照组、IL-22水平均低于对照组，以联合2组变化明显(P<0.05)。联合2组IL-17水平低于对照组(P<0.05)。结论 FSN联合MTX能够抑制RA FLS增殖，升高IL-10、Foxp3表达，降低IL-17、ROR-γt表达，调节Treg/Th17免疫平衡，以0.1 mg/mLFSN+0.1 mg/mL MTX的效应最为明显。

甲氨蝶呤；复方风湿宁；类风湿性关节炎；调节性T细胞

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性进行性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎及对称性关节骨、软骨破坏为主要特征。多数患者发病时成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)存在病理性增生。RA病因尚不清楚，但多项研究表明它的发生与免疫异常有关，CD4+T细胞免疫功能紊乱是其发病的关键环节[1]。调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)和辅助性T淋巴细胞17(T helper cell 17，Th17)是近年来发现的新型T细胞亚群，在分化、发育以及功能发挥的过程中受到Th1型、Th2型效应细胞以及自身分泌的细胞因子调节，参与自身免疫病、感染、肿瘤等疾病的发生和发展[2]。已有研究证实[3]，在RA中存在一个重要平衡，即Treg/Th17 平衡，平衡一旦被破坏，将引发疾病，维持Treg/Th17的平衡对于RA 的治疗非常重要。通过对Treg和Th17分化发育和功能发挥过程中关键因子进行增强或抑制，可以调节Treg/Th17的平衡关系，用于RA预防和治疗。

复方风湿宁和甲氨蝶呤均为临床上治疗RA常用药物。其中FSN有效成分从七叶莲、宽筋藤、两面针等中药提取，具有祛风、除湿、止痛的作用，同时还能发挥活血、散瘀、解毒功能[4]；MTX是一种叶酸还原酶抑制剂，能够抑制二氢叶酸还原为有生理活性的四氢叶酸，进而抑制DNA的生物合成，可有效抑制自身免疫反应过度激活[5]。FSN和MTX均为临床上治疗RA的核心药物，但其抗RA的机制是否与调节Treg/Th17免疫平衡有关目前尚未明确。为此，本课题将探讨FSN联合MTX对RA FLS Treg/Th17免疫平衡的影响及其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 人关节滑膜组织取自桂林医学院附属医院收治并行膝关节置换术的RA患者，采集后保存于无菌含双抗Hank’s液中，并于30 min之内转移至实验室进行细胞培养。RA患者符合中华医学会风湿病学分会《类风湿关节炎诊治指南》[6]诊断标准，告知患者研究事项，且患者均签署知情同意书。收住院后完善术前检查，进行关节镜下滑膜切除术。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂：低温高速离心机(TGL20M，麦尚仪器)；酶标分析仪(318C，上海精科)；梯度 PCR 扩增仪(600，Takara)。

甲氨蝶呤注射剂(齐鲁制药，国药准字H20045628)、复方风湿宁注射剂(广东罗浮山国药，国药准字Z20027146)，溶于无菌生理盐水，调整初浓度均为10 mg/mL，临用前稀释成所需要的浓度。DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶及I型胶原蛋白酶(GIBCO)；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt引物(上海玉博生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑盐(上海生工)；RNA提取试剂盒(美国Promega公司)；逆转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；IL-10、IL-17、IL-22 ELISA试剂盒(CUSABIO公司)。

1.2.2 RA FLS细胞培养：滑膜组织在无菌条件下PBS液冲洗3次，剪取滑膜时剔除连带血管、脂肪及软组织，取出滑膜后用PBS液冲洗3次。将滑膜剪到最小为止，1000 r/min离心5 min，弃上清，用4 mg/mL的I型胶原蛋白酶消化120 min(37 ℃、5% CO2恒温孵育)后1000 r/min离心10 min，弃上清，用PBS重悬，再次1000 r/min离心10 min，弃上清，最终悬浮于含青-链霉素(100 U/mL)及10%FBS DMEM培养液，37 ℃、5% CO2恒温孵育。72 h后更换培养液，第一次换液时采取半量换液法，此后隔天换液，显微镜下观察细胞生长情况。当原代细胞长满瓶底时，以胰酶消化进行传代培养。并留取3～4代稳定细胞用于本次实验。

1.2.3 细胞分组及干预：取对数生长期的RA FLS，用胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔100 μL，继续培养24 h后吸弃培养基，按照不同药物处理方法设置10个分组：FSN 1、2、3组(0.01、0.1、1.0 mg/mLFSN)，MTX 1、2、3组(0.01、0.1、1.0 mg/mL MTX)，联合1、2、3组(0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX、0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX、1.0 mg/mLFSN+1.0 mg/mL MTX)，并以未加药培养基作为对照组。

1.2.4 FLS增殖检测方法：采用MTT法测定细胞增殖能力，方法如下：给药后继续培养48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，在孵箱中继续培养4 h，待培养基颜色变为深蓝色后吸除液体，加入150 μL DMSO溶液，在摇床上快速震荡10 min使细胞充分裂解，而后在酶标仪上测定570 nm处的吸光度(OD)值。计算细胞增殖抑制率：IR(%)=(1-A给药/A对照)×100%，6个复孔均值作为一组结果。

1.2.5 mRNA含量检测方法：采用RT-PCR方法检测，取对数生长期的RA FLS，调整细胞浓度为3×104个/mL，接种于24孔板，每孔500 μL，继续培养24 h后吸弃培养基加入含药培养基进行药物干预，据1.2.3结果选取联合2组，FSN2组，MTX2组及不加药培养基作为对照组，共4组。加药后继续培养24 h，后收集细胞于1.5 mL离心管中，5000 r/min 4 ℃离心5 min吸出上清液(ELISA备用)，加入Trizol，严格按照试剂盒说明书提取RNA，并采用1.2%琼脂糖凝胶电泳测定其分子质量。反转录合成cDNA(严格按照试剂盒说明书操作)，检测mRNA含量时，采用RT-PCR试剂盒分别扩增β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt，PCR循环扩增条件为：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 30 s；β-actin、IL-10、IL-17、Foxp3、ROR-γt分别58 ℃、55 ℃、55 ℃、57 ℃、56 ℃1 min；72 ℃ 1 min)34个循环，72 ℃延伸10 min,4 ℃ 30 min。

所用引物序列如下：

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primers sequences

取PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外线下识别电泳条带，用凝胶成像分析软件分析，以特异性产物扩增条带灰度值与内参条带灰度值之比为半定量数据，分析4组基因表达水平，计算目的基因mRNA的相对含量，3个均值作为一组结果。

1.2.6 IL-10、IL-17、IL-22水平：以3000 r/min离心20 min取上清液(取1.2.5中提取RNA前吸出的上清液)，用ELISA法对IL-10、IL-17、IL-22水平进行检测,严格按照说明书操作，测定吸光度，根据标准曲线计算IL-10、IL-17、IL-22浓度，8个复孔均值作为一组结果。

2 结果

2.1 MTT检测OD值及抑制率比较 MTT检测结果显示，与对照组相比，FNS各组、MTX各组和联合各组FLS增殖OD值均降低(P<0.05)，但以联合2组增殖OD值降低最明显(P<0.05)，抑制率最高。见表2。

表2 各组纤维样滑膜细胞增殖OD值与抑制率比较(n=6)Tab.2 Comparison of OD values of FLS proliferation and inhibition rate(n=6)

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与联合2组比较，compared with combination group 2

2.2 IL-10、IL-17、Foxp3，ROR-γt的mRNA含量 各组RT-PCR凝胶电泳图见图1。与对照组比较，联合2组、MTX 2组、FSN 2组IL-10、Foxp3 mRNA含量明显升高(P<0.05)；联合2组、FSN 2组IL-17、ROR-γt mRNA含量明显降低(P<0.05)；MTX 2组ROR-γt mRNA 含量明显降低(P<0.05)。与联合2组比较，MTX 2组、FSN 2组IL-10、Foxp3 mRNA含量明显降低(P<0.05)；IL-17、ROR-γt mRNA含量明显升高(P<0.05)。见表3。

图1 各组RT-PCR凝胶电泳图1-2：对照组，3-4：联合2组，5-6：MTX2组，7-8：FSN2组Fig.1 RT-PCR gel electrophoresis figure of each group1-2：control group，3-4：combination group 2，5-6：MTX group 2，7-8：FSN group 2

组别IL-10IL-17Foxp3ROR-γt对照组0.12±0.030.89±0.020.13±0.011.09±0.04联合2组0.48±0.06*0.35±0.01*0.44±0.03*0.36±0.02*MTX2组0.29±0.05*#0.92±0.090.28±0.02*#0.90±0.04*#FSN2组0.28±0.02*#0.65±0.03*#0.27±0.05*#0.69±0.07*#

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与联合2组比较，compared with combination group 2

2.3 IL-10、IL-17、IL-22水平 与对照组相比，联合2组、MTX 2组、FSN 2组IL-10水平增高(P<0.05)；与联合2组相比，MTX 2组、FSN 2组IL-10水平降低(P<0.05)。与对照组相比，联合2组IL-17水平降低(P<0.05)。与对照组相比，联合2组、MTX 2组、FSN 2组IL-22水平降低(P<0.05)；与联合2组相比，MTX 2组、FSN 2组IL-22水平增高(P<0.05)。见表4。

组别IL-10IL-17 IL-22对照组35.50±3.93149.91±26.62188.13±13.67联合2组77.25±7.21*107.72±21.86*109.53±12.69*MTX2组62.52±4.90*#129.85±19.98147.98±5.86*#FSN2组65.12±8.10*#128.60±20.96154.51±9.70*#

*P<0.05，与对照组比较，compared with control group；#P<0.05，与联合2组比较，compared with combination group 2

3 讨论

FLS过度增生和局部炎性反应是RA的两大临床病理特征，研究表明[7]，RA发病过程中，FLS可由正常水平的1～3层细胞增至15 层以上；且增生的FLS具有类似肿瘤细胞的高侵袭性，凋亡反应受到抑制，持续分泌大量基质金属蛋白酶，破坏软骨组织。因此治疗RA最重要的是要保护滑膜。本次实验以RA FLS为研究对象，探讨FSN联合MTX是否可抑制骨破坏及其可能机制。并采用MTT法分析了滑膜细胞的增殖情况，结果显示：FSN和MTX治疗后均能抑制FLS的增殖(P<0.05)，但以2者联合使用时抑制率最为明显，且以0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX抑制率最高。

辅助性T细胞亚群Th1和Th2是最先被认识的T细胞亚群，Th1/Th2比例失衡是导致自身免疫性疾病发生的关键环节[8]。Th1细胞所分泌的细胞因子具有促炎、加强免疫反应的作用，而Th2型细胞因子则能抑制Th1细胞的功能。RA患者多存在Th2细胞功能减弱、无法有效抑制自身免疫反应的情况[9]。Treg 和Th17细胞是新近发现的CD4+T细胞亚型，已有文献报道[13]表明，Treg和Th17细胞在RA的致病过程中发挥着极为重要的作用，调节Th17/Treg平衡已逐渐成为治疗RA的新途径，进一步推进了对RA 发病机制的研究阶段，成为治疗RA研究的又一热点。

Treg是一群包含了CD4+T细胞、CD8+T细胞以及自然杀伤细胞的一群具有免疫调节功能的T细胞亚群，其中以CD4+CD25+Treg最为重要[10]。CD4+CD25+Treg能够抑制抗原递呈细胞的功能、降低致炎因子分泌、维持免疫内环境稳定的功能[11]。Foxp3是Treg细胞表面最可靠的标志物，在绝大多数CD4+CD25+Treg细胞中均有表达[12]，Foxp3发挥转录因子的作用，能够促进免疫抑制因子IL-10等的分泌，具有负性免疫调节以及维持自身免疫耐受的功能。Th17细胞是一群能够分泌白细胞介素-17的CD4+T细胞亚群，不仅可以大量分泌IL-17，还能产生IL-21、IL-22，具有极强的促炎作用，能够促进滑膜细胞分泌多种细胞因子、抑制软骨基质合成、增强破骨细胞的功能，最终造成骨质破坏[13]。在RA患者体内，ROR-γt的转录因子功能增强、IL-17含量增多，且Foxp3的转录因子功能减弱[14]。然而，目前有关FSN联合MTX治疗RA与Treg/Th17之间的关系还未见报道，为此本实验采用FSN和MTX联合干预RA FLS后，Real-time PCR法检测各组细胞IL-10及其转录因子Foxp3、IL-17及其转录因子ROR-γt的mRNA表达，并用ELISA法检测各组IL-10、IL-17水平。结果显示，MTX与FSN联合用药可以显著增加IL-10、Foxp3表达并降低IL-17、ROR-γt的表达，达到调节Treg/Th17平衡的目的。

Th17细胞分泌产生的另一种炎症因子IL-22，在炎症免疫性疾病的发病机制中介导了重要环节。IL-22能促进RA成纤维样滑膜细胞增殖及趋化因子的分泌，是RA发病中一种重要的炎性因子[15]。新近研究显示，RA患者的滑膜液中存在大量的IL-22，IL-22缺陷的CIA模型鼠，关节炎的发病率和炎症严重程度降低[16]，且IL-22能促进RA滑膜细胞增殖，提示IL-22在RA中的致病性[17]。IL-22高表达还可促进纤维细胞膜表面RANKL增加，加速破骨细胞生成。故IL-22可作为RA早期骨侵蚀的血清学标志，预测发病程度。本研究在前期实验中对IL-22做过重点考察，发现MTX和FSN均能降低RAFLS IL-22 mRNA表达水平，且联合应用时效果最佳。本次实验采用ELISA法检测各组IL-22水平发现，2者联合用药显著降低IL-22水平，这与前期实验结果一致。

本实验提示，FSN联合MTX能够抑制滑膜成纤维细胞增殖，并可能通过增高IL-10、Foxp3提高Treg，降低IL-17、ROR-γt及IL-22的表达降低Th17，调节Treg/Th17免疫平衡，从而抑制破骨细胞形成，防止骨质破坏，控制RA病情，但是本实验由于样本量较小并且尚未进行动物实验对照，其作用机制有待进一步研究。

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(编校：王俨俨)

Effect of compound Fengshining combined with methotrexate on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

LI Xiao-jia1, ZHAO Ying-jie2, SUN Guang-chen3Δ

(1.Department of Immunology, Guilin Medical University, Guilin 541000, China; 2.Department of Orthopaedics, The Second Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 3.College of Pharmacy, Guilin Medical University, Guilin 541000, China)

ObjectiveTo study the effect of compound Fengshining (FSN) combined with methotrexate (MTX) on Treg/Th17 immune balance in fibroblast-like synoviocytes (FLS) with rheumatoid arthritis (RA).MethodsRA FLS were cultured in vitro and treated with FSN and MTX.They were divided into ten groups: FSN 1, 2, 3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL FSN), MTX 1,2,3 groups (0.01, 0.1, 1.0 mg/mL MTX), combination 1,2,3 groups (0.01 mg/mL FSN+0.01 mg/mL MTX, 0.1 mg/mL FSN+0.1 mg/mL MTX, 1.0 mg/mL FSN+1.0 mg/mL MTX) and the medium without drugs as control group.FLS proliferation was detected by MTT method. IL-10,IL-17, Foxp3, ROR-γt mRNA were detected by real-time PCR method. IL-10, IL-17，IL-22 levels were detected by ELISA method.ResultsOD values of FLS proliferation in FSN groups, MTX groups and combination groups were significantly lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 mRNA, Foxp3 mRNA in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and ROR-γt mRNA were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 mRNA in FSN 2 group and combination 2 group were lower than those in control group, especially the combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-10 level in FSN 2 group, MTX 2 group and combination 2 group were higher and IL-22 levels were lower than those in control group, especially combination 2 group changed significantly (P<0.05).IL-17 level in combination 2 group were lower than those in control group (P<0.05).ConclusionCompound Fengshining combined with methotrexate could inhibit RA FLS proliferation, elevate IL-10 and Foxp3 expression, reduce the IL-17 and ROR-γt expression and adjust Treg/Th17 immune balance; effect of 0.1 mg/mL FSN +0.1 mg/mL MTX is the most obvious.

methotrexate; compound Fengshining; rheumatoid arthritis; regulatory T cells

国家自然科学基金(81260462，81460474)

李晓佳，女，硕士，研究方向：免疫药理，E-mail：417517652@qq.com；孙广臣，通讯作者，男，博士，研究员，研究方向：免疫药理，E-mail：sungc2004@aliyun.com。

R593.2

A

1005-1678(2015)06-0006-04