丝素蛋白基人工角膜多孔支架的细胞相容性研究

宋大伟 马义宾 聂蓉晖

角膜病是一种发病率高、治疗困难的致盲性眼病。据资料报道，我国因角膜病需要接受角膜移植手术患者约在500 万人以上，但由于角膜资源严重短缺，每年全国进行的角膜移植手术仅为5 000 例左右，绝大部分角膜损伤或角膜病患者没有条件医治［1］。人工角膜的研究和发展有望解决角膜资源短缺的问题，为角膜病患者带来治愈的希望。但目前人工角膜的研究仍处于初级阶段，普遍存在生物相容性低的问题［2］。蚕丝是最具有中国特色的一种天然蛋白质生物材料，由于其优异的生物相容性、力学性能和降解性能，日益成为组织工程学领域的研究热点［3］。本研究以丝素蛋白基人工角膜为基础材料，研究其细胞相容性，为人工角膜的生物学检测和体内应用打下良好基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

5 只健康新西兰白兔(购自南京金陵种兔场)，2 ～3 月龄，体质量2.0 ～2.5 kg，雌雄不限。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明，无眼前节病变。

1.2 主要试剂和仪器

利用盐析法制备丝蛋白多孔支架(苏州大学现代丝绸实验室)。DMEM、胰蛋白酶(美国Gibco 公司)，胎牛血清(中美合资兰州民海生物)，EDTA(乙二胺四乙酸二钠，美国AMRESCO 公司分装)，MTT(美国Sigma 公司)。CO2培养箱(上海力新仪器公司，HF121UV)，倒置相差显微镜(日本奥林巴斯，OLYMPUS CKX41)，酶标仪(美国Bio-Rad 公司，Model 860)，扫描电镜(德国蔡司，Supra55VP)，激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司，DMIRE2)。

1.3 实验方法

1.3.1 兔角膜成纤维细胞的培养和鉴定

空气栓塞法处死新西兰白兔，在无菌条件下迅速摘取眼球，用含庆大霉素的生理盐水(1 000 U/mL)冲洗眼球，在解剖镜下撕去内皮及后弹力层，刮除上皮层，PBS 漂洗2 次，用眼科剪将角膜基质剪成约1 mm×1 mm 的组织小块，平铺于培养瓶壁后放置37 ℃、5%CO2培养箱内2 h。待组织块稍干、附着瓶壁后，加DMEM 培养液置于培养箱中培养，待细胞汇合成片后，用含0. 25% 胰蛋白酶和0. 02%EDTA (1 ∶1)的混合消化液消化后传代培养。实验所用为传2 ～10 代细胞，取第2 代细胞进行波形蛋白免疫组织化学鉴定，鉴定方法见参考文献4。

1.3.2 丝蛋白溶液的制备

将生丝(购自苏州制丝厂)放置到浓度为0.02 M的碳酸钠溶液中，100 ℃处理20 min，去除生丝表面的丝胶蛋白。脱胶后的丝蛋白纤维用去离子水充分洗涤后，放置于60 ℃烘箱中烘干，再将其加入浓度为9.3 M 的溴化锂溶液中，60 ℃烘箱放置4 h，获得丝蛋白的溴化锂溶液。随后将丝蛋白溶液装入透析袋(截留分子量14 000)，在流动自来水中透析48 h后改用去离子水透析，每4 小时换水1 次，持续24 h。透析得到的丝蛋白溶液经过在9 000 rpm 条件下离心2 次，每次20 min，获得澄清的丝蛋白溶液，浓度约为7%。

1.3.3 丝蛋白－明胶多孔支架的制备

将明胶加入去离子水中，加热到60 ℃，获得明胶水溶液，调整明胶含量，制备质量浓度为2%的明胶溶液。将明胶溶液同丝蛋白溶液共混，通过改变两种溶液的配比，获得含有不同浓度明胶和丝蛋白的混合溶液。混合溶液中丝蛋白溶液浓度保持在3%，而明胶浓度分别为0.75%和1.28%，多孔支架制备完成后，明胶含量为20%、30%。将上述混合溶液放置到－20 ℃冰箱内12 h，然后使用冷冻干燥机冷冻干燥48 h。获得的样品放置于底部加有去离子水的干燥器中，抽真空处理6 h，获得不溶于水的多孔支架［6］。同时，利用盐析法［6］制备丝蛋白多孔支架进行对比研究。

1.3.4 兔角膜成纤维细胞在丝素蛋白基人工角膜上培养

将丝素蛋白－明胶多孔支架切成直径5 mm、厚度2 mm 的圆柱形，并用70%乙醇浸泡消毒30 min，随后以PBS 洗涤3 次后放入24 孔板。在种植细胞之前，将支架在1 mL 培养液中放置12 h，使其充分吸收培养液以提高细胞黏附。细胞的种植密度为2 ×104/cm2。培养液每2 天更换1 次，培养时间为14 d［7］。作为对照，采用相同方法在盐析法制备的丝素蛋白支架上进行细胞培养。

1.3.5 细胞活性和形貌

兔角膜成纤维细胞的活性通过DNA 含量测定试剂盒测定(美国Molecular Probes 公司)［8］。将种植细胞的多孔支架经PBS 清洗后，加入含有2 ×10－3M 钙黄绿素-AM (用于活细胞染色)和4 ×10－3碘化丙啶(用于死细胞染色)的溶液，于37 ℃培育30 min。随后使用PBS 清洗，并通过激光共聚焦显微镜观察细胞活性［9］。将经PBS 清洗后的多孔支架以10%中性福尔马林溶液固定，随后在室温下使用四氧化锇溶液进一步固定2 h。将固定后的样品利用梯度乙醇溶液脱水，并在通风橱内干燥。喷金后使用扫描电镜观察细胞形貌。

2 结 果

多孔支架上体外培养1 d 后，细胞在所有支架上都表现出良好的黏附性，有大量伪足形成。明胶含量20%支架上的细胞数量多于单纯丝素蛋白支架上的细胞数量，而明胶含量30%支架上的细胞数量多于明胶含量20%支架上的细胞数量(见图1)。

图1 多孔支架上体外培养1 d 后兔角膜成纤维细胞扫描电镜图(1 ∶1 000 和1 ∶5 000)

多孔支架上体外培养14 d 后，所有支架上的细胞均有显著增殖，并有大量细胞外基质形成。丝素蛋白支架上细胞数目在体外培养10 d 时达到最大值，之后随着时间推移，细胞数目开始降低。而在明胶含量为20%、30%丝素蛋白－明胶多孔支架上，细胞数目在14 d 的连续培养过程中持续增加;14 d时，不同明胶含量的丝素蛋白－明胶多孔支架上的细胞数目均显著高于盐析法制备的丝素蛋白多孔支架上的细胞数目，明胶含量为30%的丝素蛋白－明胶支架培养细胞数目及活细胞数目明显多于20%者(见图2)。

在激光共聚焦显微镜下观察，所有支架上培养14 d 时细胞数目明显多于培养1 d;而且培养14 d时30%丝素蛋白－明胶多孔支架上的细胞数量及活细胞数量高于20%者;20%丝素蛋白－明胶多孔支架上的细胞数量及活细胞数量明显多于盐析法制备的丝素蛋白多孔支架(见图3)。

3 讨 论

在生物医学领域，丝素蛋白最早被用于手术缝合线。最近20 年，越来越多的研究表明丝素蛋白能够用于生物医学和组织工程的多个领域［12］。随着研究的不断深入，研究者发现丝素蛋白是多种组织再生(如骨、软骨、血管、神经以及皮肤)的良好载体，并已经有多种产品进入临床试验，表明丝素蛋白的生物相容性完全能够满足人工角膜的要求，是一种潜在的人工角膜材料［13］。

图3 多孔支架上培养的兔角膜成纤维成纤维细胞的激光共聚焦显微镜图(1 ∶700)

理想的人工角膜需要具有良好的力学性能和生物相容性，有利于细胞的黏附和生长，避免炎症反应的发生，同时还要具有良好的光学性能，实现角膜的功能。近年来，天然生物材料由于其优异的生物相容性受到研究者的普遍重视［10］。

细胞相容性尤其是成纤维细胞的相容性是评价人工角膜周边支架的重要指标［7］。通过调控丝蛋白溶液的挥发速率，可直接从其水溶液中获得不溶的、能够用于人工角膜光学部件的丝蛋白薄膜，并提高其柔韧性［10］。明胶是具有优异生物相容性的生物大分子，将二者性能完美结合，制备出丝素蛋白－明胶多孔支架，可进一步提高丝素蛋白支架的细胞相容性，满足人工角膜的要求［9］。

为了方便同盐析法制备的丝素蛋白多孔支架做比较，本研究制备丝素蛋白－明胶多孔支架的丝素蛋白－ 明胶混合溶液中，明胶的浓度分别20% 和30%，从而使制备出的多孔支架同盐析法制备的丝素蛋白支架具有相似的孔径。将兔角膜成纤维细胞在3 种不同的丝素蛋白多孔支架上进行培养，以评价丝素蛋白－明胶多孔支架的相容性。

通过扫描电镜观察成纤维细胞的形貌发现，兔角膜成纤维细胞在所有支架上都表现出良好的黏附性，有大量伪足形成。随着时间推移，细胞数目显著增加，并有大量细胞外基质形成。表明盐析法制备的单纯丝素蛋白支架和丝素蛋白－明胶多孔支架都能很好地促进细胞生长。

在单纯丝素蛋白支架上，细胞数目在体外培养10 d 时达到最大值，之后随着时间推移增殖细胞数目开始降低，死亡细胞开始出现并增多;而在丝素蛋白－明胶多孔支架上，细胞数目在14 d 的培养过程中持续增加，并且活细胞一直保持较高的含量。明胶含量达30%的支架上，细胞表现出更高的活性，死亡细胞含量极低。这表明通过将明胶加入丝素蛋白溶液，不仅有利于形成更好的孔结构，同时还进一步提高了支架的细胞相容性，使其能更好地满足角膜组织再生的要求。

本研究表明，丝素蛋白－明胶多孔支架与原代分离的兔角膜成纤维细胞具有较好的细胞相容性，能够更好地促进成纤维细胞的生长和增殖;明胶的加入使得丝素蛋白－明胶支架具有更好的细胞相容性，可满足角膜组织再生的要求，为丝素蛋白基人工角膜的进一步研究奠定了基础。

1 许凤兰. 纳米羟基磷灰石/水凝胶人工角膜研究［D］. 四川:四川大学，2005.

2 杨朝忠，柳林. 现代角膜移植学［M］. 北京:人民军医出版社，1998:167-170.

3 Wei G，Ma PX. Partially nanofibrous architecture of 3D tissue engineering scaffolds［J］. Biomaterials，2009，30(32):6426-6434.

4 殷晓棠，孙旭光，金秀英，等. 羟基磷灰石人工角膜支架生物相容性的实验研究［J］. 眼科研究，2001，19(3):193-194.

5 陈家祺，张胜，郭琳洁，等. 体外培养重建角膜组织的技术探讨［J］. 中国实用眼科杂志，2001，19(11):815-817.

6 Lu Q，Zhu H，Zhang C，et al. Silk self-assembly mechanisms and control from thermodynamics to kinetics［J］. Biomacromolecules，2012，13(3):826-832.

7 Ma PX. Biomimetic materials for tissue engineering［J］. Adv Drug Deliv Rev，2008，60(2):184-198.

8 Woo KM，Jun JH，Chen VJ，et al. Nano-fibrous scaffolding promotes osteoblast differentiation and biomineralization ［J］.Biomaterials，2007，28(2):335-343.

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10 Lu Q，Hu X，Wang X，et al. Water-insoluble silk films with silk Ⅰstructure［J］. Acta Biomater，2010，6(4):1380-1387.

11 Lu Q，Zhang X，Hu X，et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds［J］. Macromol Biosci，2010，10(3):289-298.

12 朱志忠，周道伐，黎勉勤. 角膜病［M］. 北京:人民卫生出版社，1986:84-97.

13 Lu S，Wang X，Lu Q，et al. Stabilization of enzymes in silk films［J］. Biomacromolecules，2009，10(5):1032-1042.