转酪氨酸激酶C 基因神经干细胞移植对脊髓损伤后热休克蛋白的影响

李嘉欣 朱小兰 周正芳，3 黄焕雷 郭惠明 范瑞新 郑少忆范小平 陈寄梅 庄建 朱平

心脏大血管手术并发的缺血再灌注损伤可引起脊髓损伤，严重时可导致患者术后轻瘫或截瘫，是影响手术预后的严重问题［1］。目前，脊髓损伤仍无有效的预防及治疗方法，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)移植有望恢复受损脊髓的神经功能［2］。然而，一般的NSCs 移植后不仅生存率低，而且会分化成胶质细胞参与胶质瘢痕的形成［3］。因此，有必要改造或调节NSCs 在脊髓中的分化和迁移。酪氨酸激酶C(tyrosine kinase C，TrkC)是神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)的高亲和力受体［2］，NT-3 与NSCs 的TrkC 受体结合可促进NSCs 分化和迁移［4］。在脊髓缺血再灌注损伤过程中，应激反应是主要的损伤机制［5］，应激状态刺激热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)快速大量合成与释放［6］。研究发现，在应激反应中，HSP70 有抑制脂质氧化、保护线粒体以及维持蛋白自稳等作用，能发挥抗氧化应激的作用［7］。因此，我们通过将转TrkC 基因NSCs 移植至受损脊髓内，观察HSP70 的浓度改变以及脊髓的病理改变，初步探讨转TrkC 基因NSCs移植对脊髓损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 NSCs 的培养和鉴定

选择孕14 d Wistar 大鼠(购自中山大学实验动物中心)，所有实验方案经广东省人民医院伦理委员会批准通过。取出Wistar 大鼠胎脑海马组织，机械消化成单细胞悬液。加入NSCs 全培养液，悬浮培养、传2 代后使用。为了对照和区别本研究真正需要的NSCs，首先在无血清培养基中观察细胞开始分化的时间、数量及形态;此后再使用含生长因子的无血清培养基，使NSCs 分裂而不分化。NSCs 鉴定:原代培养细胞均为圆形亮球状，第3 天开始贴壁分化，细胞渐渐变为梭形，伸出突起;第6 天出现大量神经元和神经胶质细胞，突起交织成网状。细胞共有4 种不同形态:悬浮圆形亮球状NSCs 样细胞;具有1 ～2 个突起的神经元样细胞;多个细突起且不断分支的少突胶质细胞样细胞;多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞。含生长因子培养基中的NSCs 大多为圆形亮球状，于第3 天可见正在分裂细胞，并在第4 天可见神经球;亦可见有贴壁分化伸出突起的细胞，但这些细胞活力渐渐减小，于第5 天完全凋亡。

1.2 转TrkC 基因NSCs 的制备

(1)TrkC 引物设计和合成:根据GenBank TrkC cDNA 全长序列设计合成引物(Invitrogen 公司)，片段长度249 bp;(2)提取鼠脑总RNA:取0.1 ～0.5 g Wistar 胎鼠脑组织，用Trizol 法(Life Technologies 公司)提取细胞总RNA，在紫外分光光度计上测定230 nm 处吸光度(A)值，并以琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整;(3)用逆转录PCR 试剂盒(Takara 公司)，将mRNA 逆转率成cDNA，回收目的片段;(4)外源性TrkC cDNA 的连接:将pMD18-T 质粒(Takara 公司)和回收目的cDNA 片段用Kpn Ⅰ+Hind Ⅲ(Invitrogen 公司)双酶切，T4 DNA 连接酶(Invitrogen 公司)连接，获得pMD18-T-TrkC 质粒;(5)转化、扩增与提取pMD18-T-Trkc 质粒;(6)TrkC基因测序;(7)pECFP-C1-TrkC 质粒的构建:同步骤(3);(8)脂质体2 000(Invitrogen 公司)/pMD18-TTrkC 质粒转染NSCs;(9)免疫荧光检测TrkC 的表达:一抗为兔抗TrkC，二抗为羊抗兔IgM-罗丹明(均购自伯信生物科技有限公司)。

1.3 脊髓缺血损伤大鼠模型的建立与分组

90 只清洁级Wistar 大鼠(购自中山大学实验动物中心)，雌雄不拘，9 周龄，300 ～350 g。实验在室温25 ～28 ℃的环境中进行，大鼠以苯巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后安装人工呼吸器，切开胸部，在左锁骨下动脉末梢处给降主动脉缠胶带。随后经皮将温度探头放置在腰椎椎管内，监测脊髓温度。全身肝素化后，在体外循环下于左锁骨下动脉末梢处阻断降主动脉，50 min 后解除阻断，闭合胸部切口，继续饲养。整个实验过程中，持续监测脊髓温度和诱发电位，脊髓温度逐渐下降提示降主动脉阻断处以下部位的循环已停滞，脊髓发生缺血;体感诱发电位P1 潜伏期和波幅出现明显变化提示脊髓发生缺血再灌注损伤。90 只大鼠均建模成功，将大鼠模型随机分为3 组(每组30 只):(1)单纯阻断组，只进行单纯阻断降主动脉;(2)NSCs 移植组，阻断降主动脉术后1 d 进行单纯NSCs 移植;(3)TrkC-NSCs 移植组，阻断降主动脉术后1 d 进行转TrkC 基因NSCs 移植。

1.4 NSCs 移植

固定大鼠，自腰、骶椎处做约0.5 ～1.0 cm 皮肤切口，暴露皮下组织，于L5 ～L6 或L6 ～L7 间隙沿下一棘突上方用毛细穿刺针穿刺，针尖斜向头端，针体与水平线约呈40°角进针约1.5 ～2.0 mm 到达蛛网膜下腔，仔细体会有落空感。用10 μL 的Hamilton 注射器经微量注射泵以1.5 μL/min 的注射速度进行移植，注射1.5 μL 细胞悬液，细胞总数为2×105个。注射完毕后保持注射器于原位约1 min，再缓慢退出。单纯阻断组则注射等量等渗NaCl 溶液。

1.5 脊髓组织取材和染色

每组于移植术后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分别处死3 只大鼠，将其以俯卧位固定于实验台上，背部备皮，依次切开皮肤、皮下组织、肌肉，分离椎旁肌，充分暴露L2 ～L4 段脊椎棘突及椎板。以咬骨剪和咬骨钳去除棘突及椎板，暴露脊髓组织，以镊子迅速轻轻取出脊髓组织，分段送检。采用HE 染色观察大鼠脊髓组织病理学改变，采用TUNEL 染色观察脊髓细胞凋亡情况，采用Nissl 染色观察神经元尼氏小体变化;染色方法均同参考文献8。

1.6 ELISA 检测HSP70 水平

每组于移植术后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分别取3 只大鼠割尾静脉采血，室温静置2 h 后离心(3 000 rpm，10 min)分离出血清，置于室温下充分混匀。根据大鼠HSP70 ELISA 试剂盒(Enzo Life Sciences公司)说明书准备试剂，按照要求将标准品或待测样本加入酶标板，并做好标记;温育后加入底物，充分混匀;在室温下避光反应15 min 后，加入终止液，充分混匀;在30 min 内使用酶标仪(SpectraMax M5，美国Molecular Devices 公司)在450 nm 处读取A 值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 20. 0 统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差(¯x ±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P ＜0.01 为差异有统计学意义。

2 结 果

术后5 个时间点中，3 组大鼠脊髓组织细胞形态在术后1 周时差异最为明显。

2.1 HE 染色结果

术后1 周，单纯阻断组可见神经细胞受损、变性、坏死，形态肿胀，出现空泡化，有核固缩、核溶解现象;NSCs 移植组部分神经细胞肿胀，可见嗜酸性细胞核，部分细胞浆呈空泡状，但不及单纯阻断组严重;TrkC-NSCs 移植组神经细胞形态接近正常，染色均匀(见图1)。

2.2 TUNEL 染色结果

术后1 周，单纯阻断组可见广泛分布的呈棕色颗粒细胞核的凋亡细胞，其细胞质减少;NSCs 移植组可见一定量的凋亡细胞，其细胞质减少;TrkCNSCs 移植组只见散在的凋亡细胞(见图2)。

2.3 Nissl 染色结果

术后1 周，单纯阻断组可见尼氏小体溶解成沙粒状，核溶解及空泡现象比较严重;NSCs 移植组可见核溶解现象，但程度较单纯阻断组轻;TrkC-NSCs移植组可见尼氏小体呈块状，染色较正常，神经细胞形态较完整(见图3)。

2.4 ELISA 检测结果

3 组大鼠移植术后HSP70 水平均升高，于术后72 h 达到峰值，TrkC-NSCs 移植组各时间点的HSP70 水平均高于另外两组，差异有统计学意义(P均＜0.01)。详见表1。

3 讨 论

图1 神经干细胞移植术后1 周3 组大鼠脊髓组织标本HE 染色结果(×400)

图2 神经干细胞移植术后1 周3 组大鼠脊髓组织标本TUNEL 染色结果(×400)

图3 神经干细胞移植术后1 周3 组大鼠脊髓组织标本Nissl 染色结果(×400)

表1 NSCs 移植术后不同时间点3 组大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

表1 NSCs 移植术后不同时间点3 组大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

注:NSCs. 神经干细胞;TrkC. 酪氨酸激酶C;HSP70. 热休克蛋白70

在心脏大血管手术中，阻断主动脉血流导致的脊髓缺血再灌注损伤可引起术后轻度瘫痪，甚至截瘫［9］。及时预防并治疗脊髓损伤是提高患者预后的关键。目前已知脊髓缺血再灌注损伤是一个多因素参与的过程，包括应激反应、氧自由基损伤、兴奋性氨基酸毒性损伤以及炎症等［9-11］。热休克蛋白家族具有调控细胞周期、调节细胞增殖、调节细胞存活与凋亡等多种功能［12］。研究发现，在脊髓缺血再灌注损伤过程中，尤其是在应激反应中，HSP70 快速大量释放，发挥对抗氧化应激及保护细胞的作用［7］。而且，HSP70 在神经细胞及神经胶质细胞中差异表达，因此可利用HSP70 作为心脏大血管手术引起的早期缺血及神经细胞应激反应的标志物［6，12］。

NSCs 移植可通过细胞替代等机制治疗脊髓损伤［2］。然而，普通的NSCs 移植到受损脊髓内不仅存活率低，而且易分化成胶质细胞从而形成瘢痕，不能有效发挥神经保护作用［3］。研究发现，只需改造NSCs 或调节其在脊髓中的分化和迁移，即找到合适的靶点并提供足够的底物，就有可能恢复受损的神经功能［13-14］。TrkC 受体是NT-3 的高亲和力受体［2］。NT-3 通过与TrkC 受体的胞外区结合，将神经细胞存活和分化的信号传递到细胞内部，促进NSCs 分化为神经细胞［15］。转TrkC 基因NSCs 能高表达TrkC 受体，可提高其与内源性NT-3 的结合，从而提高NSCs 在大鼠受损脊髓中的存活率［14］。

本实验脊髓缺血损伤大鼠术后1 周脊髓组织病理学结果显示，单纯阻断组脊髓神经细胞形态肿胀，大量凋亡，尼氏小体减少;TrkC-NSCs 移植组神经细胞及其细胞器的形态最接近正常，凋亡细胞最少;NSCs 移植组神经细胞及凋亡数量介于上述两组之间;提示NSCs 移植有保护神经细胞作用，转TrkC基因NSCs 移植的神经保护作用更明显。ELISA 检测结果显示，术后各时间点单纯阻断组HSP70 浓度均为3 组中最低，NSCs 移植组HSP70 浓度高于单纯阻断组，TrkC-NSCs 移植组HSP70 水平最高;提示NSCs 移植能促进HSP70 释放，转TrkC 基因NSCs移植促进HSP70 释放的效果更明显。

综上所述，NSCs 移植对脊髓缺血再灌注损伤有保护作用，转TrkC 基因NSCs 移植的治疗效果更佳，可能是通过替代受损神经细胞，促进HSP70 释放从而减轻应激反应，继而起到神经保护的作用。但转TrkC 基因NSCs 移植对大鼠脊髓保护的具体机制仍不清楚，有待进一步的研究和探索。

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