钴在蚕豆中的积累分布及其对叶片光合作用和抗氧化酶活性的影响

王建宝，唐运来＊，徐 静，徐国聪，邹 玥，陈 浩

（1 西南科技大学 生命科学与工程学院，四川绵阳621000；2 西南科技大学 核废物与环境安全国防重点学科实验室，四川绵阳621000；3 四川省原子能研究院，成都610066）

近年来，在世界范围内随着城市化、工业化及农用化学品的过量使用，环境污染、生态破坏的形势日益严峻，严重影响到人类的生存和健康。其中重金属元素对环境的污染和破坏作用尤为严重，越来越受到人们的关注。重金属引起的土壤污染也日益成为环境、土壤科学家们研究的热点问题［1］。重金属在生物体内的行为特征主要包括吸收、迁移、富集、毒害、解毒和抗性等，因此对这几个环节的研究一直是重金属污染生态学的研究热点［2］。

钴是合成维生素B12的主要成分，参与酶的组成，并是多种酶的活化剂和抑制剂，可以改变植物体内营养物质的含量，而且还能促进植物离体部分的生长。施钴还可以提高植物的抗逆境能力，如对干旱、病虫害、低温的抵抗能力［3］。低浓度的钴对幼苗期玉米、小麦生长有促进作用，而高浓度的钴则对它们的生长有明显的抑制作用［4－5］。目前关于钴影响植物的研究主要集中在植物富集方面［6－7］，而钴对植物光合作用和抗氧化特性影响的报道几乎没有。蚕豆作为一种重要的经济作物，对其进行环境安全性的研究有着重要的意义。本研究主要通过对蚕豆幼苗植株钴富集特性及其叶片叶绿素含量、叶绿素荧光参数、光合作用参数、生长指标和相关酶活性的测定统计，分析钴在蚕豆体内的吸收、富集及对其叶片光合作用和抗氧化特性的影响，以期为后续的重金属污染生态学研究提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1．1 试验材料

供试植物为四川冬季常见植物蚕豆（Vicia fa－ba L．）品种‘成胡10号’（Chenghu No．10），属于豆科野豌豆属，生长速度快，生物量较大，根系发达，对病虫害抗性强。蚕豆种子购于四川省绵阳市农资市场，实验用土采自西南科技大学后山的菜园土，采用常规方法测定其理化性质［6］。供试土壤基本理化性质为：pH 值7．15、有机质含量5．93g·kg－1、速效磷含量7．28 mg·kg－1、碱解氮含量51．74 mg·kg－1、速效钾含量21．28 mg·kg－1、有效镁含量138．20mg·kg－1、有效钾含量450．20mg·kg－1、有效钙含量2 321．00mg·kg－1、有效钴含量1．98 mg·kg－1、全钴含量22．10mg·kg－1。

1．2 材料培养及处理

选取子粒饱满、大小一致的蚕豆种子在10月中旬播种于西南科技大学核废物与环境安全国防重点学科实验室的温室，在普通石英砂中砂培至四叶期，挑选长势一致的健康植株进行盆栽土培，缓苗至6叶期后移栽至含有混匀氯化钴的土壤的盆中，每盆3株。其中，盆中土壤钴含量设置0、20、40、80、120 mg·kg－1等5个剂量处理水平，每个处理设置5次重复（每个重复3盆），在处理14d后选取植株进行各项指标测定。

1．3 测定项目与方法

1．3．1 植株生长指标及钴含量 取不同钴浓度处理的蚕豆整株幼苗，用测微尺测量幼苗株高、根长，然后在105℃条件下杀青30min，75℃下烘干至恒重，称取其干重；而后将根、茎、叶分开研细，取3种器官干粉0．30g于10mL硝酸中，采用微波消解仪（Mars，美国CEM 公司）进行微波消解，用原子吸收光谱（AA700，美国PE公司）于240．7nm 波长下测定钴元素的含量，每个部分重复测量3次，并计算钴的富集系数和转运系数。

地上部分富集系数（aboveground enrichment factors，下简称BCFS）＝植物地上部分钴含量／（施入钴的浓度＋土壤本底值）［9］

转运系数（transfer coefficient，下简称TF）＝植物地上部分钴含量／地下部分钴含量［9］

1．3．2 叶片叶绿素含量 参照Lichtenthaler［10］的丙酮提取法提取光合色素，采用紫外分光光度计（UV3900H，日本Hitachi公司）测定各样品（提取液上清液）470、663和646nm 下的吸光值（A），每个样品测定3次重复，并依据以下公式计算：

叶绿素a含量（Chl a）＝12．21A663－2．81A646

叶绿素b含量（Chl b）＝20．13A646－5．03A663

类胡萝卜素含量（Car）＝（1 000A470－3．27Ca－104Cb）／229

1．3．3 叶片光合气体交换参数 选取从上到下第三片完全展开的成熟叶片，采用便携式光合仪（Li－6400，美国Li－COR公司），于上午9：00～11：30在设定光强为800μmol·m－2·s－1条件下，测定各植株净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间CO2浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr），每个处理测定5次重复。

1．3．4 叶片叶绿素荧光参数 选取从上到下第三片完全展开的成熟叶片，测定前暗适应20 min，运用多功能叶绿素测定仪（MPEA，美国），测定光系统Ⅱ最小荧光（F0）、最大荧光（Fm）、最大光化学效率（Fv／Fm）、PSⅡ潜在活性（Fv／F0）等叶绿素荧光参数，饱和脉冲的光强为10 000μmol·m－2·s－1，饱和脉冲的持续时间为600ms，饱和脉冲的间隔为20 s，每个处理测定5次重复。

1．3．5 抗氧化酶活性 称取不同浓度钴处理的植株的叶片（去叶脉）0．50g，加入适量预冷的pH 7．0磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移至10 mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液至容量瓶中并定容至刻度。将提取液转入10 mL 离心管中，于10 000g／min离心8min，取上清液4 ℃低温用于酶活测定。SOD 活性采用NBT 还原法［11］测定，POD 活性采用愈创木酚显色法［12］测定，CAT 活性采用紫外线分光光度计吸收法［13］测定。

1．4 数据处理

用统计分析软件DPSv 7．5对所有测定的指标进行方差分析，检测处理间的差异显著性，所有数据用平均值±标准差表示，并用Origin 9．0作图。

2 结果与讨论

2．1 不同浓度钴处理下蚕豆植株体内钴的积累与分布特征

从表1可以看出，蚕豆根、茎和叶部钴的富集吸收量均随着土壤中钴处理浓度的升高而增加，且处理间存在显著性差异（P＜0．05）；各器官对钴的积累吸收量趋势表现为：根＞叶＞茎。其中，根、茎、叶钴含量在钴处理浓度为20mg·kg－1时分别为相应对照（CK）的2．01、1．33、1．61倍，在40 mg·kg－1钴处理时分别为CK 的4．51、1．64、2．64倍，在120 mg·kg－1钴处理时分别为CK 的14．69、2．52、3．40倍。可见，在各浓度钴处理条件下，蚕豆植株内钴含量较CK 增加的倍数与相应土壤中钴浓度较CK 增加的倍数相比，有较为明显的增加，表现最显著的是蚕豆根部。其主要原因可能是外源钴显著提高了土壤中钴的活性，从而促进了植株对钴的吸收。

植株地上部分的富集系数BCFS代表植株地上部分富集钴的能力，而转移系数TF代表植株将根部的钴转移到地上部分的能力。由表1还可知，随着土壤中钴处理浓度的增加，蚕豆茎和叶富集钴的能力逐渐下降，蚕豆根部转移钴的能力也逐渐下降；但是，当钴浓度为120 mg·kg－1时，蚕豆BCFS和TF仍分别达到0．212和0．289。由此说明蚕豆植株的根对钴有较强的富集能力。

表1 不同浓度钴处理下蚕豆植株各器官的钴含量Table 1 Co contents in organs of broad bean seedling under different concentration treatments

2．2 钴处理对蚕豆幼苗生长的影响

由图1可知，随着土壤中钴浓度的增加，蚕豆幼苗根长、株高、干重值均呈现出先增加后降低的趋势，各处理之间均有显著差异（P＜0．05），并都高于相对应的CK 值，且均在40mg·kg－1时达到最大值；其根长、株高、生物量在钴浓度为40 mg·kg－1时分别比CK 增加44．6%、16．5%、24．5%，在钴浓度为120 mg·kg－1分别比对 照增加11．5%、12．6%和8．8%。说明在本实验的浓度范围内钴处理对蚕豆幼苗生长均具有不同程度的促进作用，但是过高浓度钴对蚕豆幼苗生长表现出的促进作用明显减弱；同时说明蚕豆幼苗对土壤中的钴有较强的耐受能力。

2．3 钴处理对蚕豆植株叶片光合色素含量的影响

叶绿素在植物光合作用的光能吸收、传递和转化等过程中具有重要作用，叶绿素含量降低是引起光合速率降低的重要原因之一［14］。由图2可知，钴处理对蚕豆叶片叶绿素含量（叶绿素a、b）主要表现为低浓度促进高浓度抑制效应，并在钴浓度为40 mg·kg－1时均达到最大值，且显著（P＜0．05）高于对照组和其余处理组。其中，叶绿素a含量在钴浓度为20和40mg·kg－1时比对照分别增加15．6%和31．5%，在80和120mg·kg－1时则比对照分别下降5．6%、14．2%；叶绿素b含量在钴浓度为20和40 mg·kg－1时分别比对照组增加17．8%和34．7%，在80和120mg·kg－1时比对照组分别下降9．6%和19．1%。同时，蚕豆叶片叶绿素a／b则表现出相反的变化趋势，即低浓度降低高浓度升高，并在钴浓度为40mg·kg－1时达到最小值。另外，蚕豆叶片类胡萝卜素含量虽然也随着钴浓度增加而先升高后降低，也在钴浓度为40 mg·kg－1时达到最大值；但与对照相比各钴处理浓度均表现为促进作用，只是随着处理浓度增加该促进作用逐渐减弱，如其在40和120mg·kg－1处理下分别比对照增加33．6%和3．5%。以上些结果表明低浓度的钴处理能显著促进蚕豆叶片光合色素的合成，而高浓度钴则显著抑制叶片叶绿素合成或者促进其降解，也显著减弱对类胡萝卜素合成的促进作用，从而使得叶片表现出缺素症状。

图1 不同钴浓度下蚕豆幼苗株高、根长和生物量的变化Fig．1 The broad bean seedling plant height，root height and biomass with different Co concentrations

图2 不同钴浓度下蚕豆叶片光合色素含量的变化Fig．2 The photosynthetic pigment contents in leaves of broad bean plants with different Co concentrations

2．4 钴处理对蚕豆植株叶片光合气体交换参数和叶绿素荧光参数的影响

由图3可知，随着土壤中钴浓度的增加，蚕豆植株叶片光合气体交换参数净光合速（Pn）、气孔导度（Gs）、胞间二氧化碳浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）均表现出先增加后降低的变化趋势，并均在钴浓度为40 mg·kg－1时达到最大值，但各指标受到促进的钴浓度和变化幅度不同。其中，与对照相比较，各浓度钴处理对蚕豆叶片的Tr均表现出不同程度促进作用，只是随着处理浓度增加其促进作用先强后弱；其余指标均表现出低浓度促进高浓度抑制的现象，蚕豆叶片的Pn和Ci均在20～80mg·kg－1的钴处理下得到促进，而其Gs在20～40mg·kg－1的钴处理受到促进，它们在其余钴浓度处理下均受到抑制；在40mg·kg－1钴处理条件下，蚕豆叶片的Pn、Ci、Tr、Gs分别比相应对照显著增加341%、181%、741%、141%。可见，蚕豆叶片光合气体交换参数对土壤中钴浓度变化的响应趋势相同，在20和40mg·kg－1钴处理下均得到促进，并且Tr变化最大，Ci、Gs变化幅度相对较小。

同时，蚕豆叶片各叶绿素荧光参数随土壤钴浓度的变化趋势与光合气体交换参数相似（图4）。蚕豆叶片的初始荧光（F0）、最大荧光产量（Fm）、光系统Ⅱ最大光化学量子产量（Fv／Fm）和光系统Ⅱ潜在活性（Fv／F0）均随着土壤中钴浓度的增加而呈现先增加后降低的趋势，且均在40 mg·kg时达到最大值；与对照相比，各指标均表现出低浓度得到促进高浓度受到抑制的现象，只是前两者的促进浓度为20～80mg·kg－1，而后两者的促进浓度分别为20和40mg·kg－1。其中，蚕豆叶片初始荧光（F0）在钴浓度为20、40和80mg·kg－1时分别比对照组增加16．1%、33．2%和5．6%，其最大荧光产量（Fm）分别增加19．6%、47．8%和1．7%，而两者在钴浓度为120mg·kg－1时分别较对照组降低2．9%和9．5%；同时，蚕豆叶片光系统Ⅱ最大光化学量子产量（Fv／Fm）在钴浓度为20和40mg·kg－1时比对照组分别增加0．8%和2．7%，其光系统Ⅱ潜在活性（Fv／F0）则分别增加3．8%和14．0%，而两者在80、120mg·kg－1浓度下分别较对照组降低1．2%、2．0%和4．7%、8．7%。可见，蚕豆叶片的叶绿素荧光参数在钴浓度为80～120mg·kg－1时均受到抑制，表明其光系统Ⅱ结构和功能在高浓度钴处理下均受到一定的损伤与破坏。

2．5 钴处理对蚕豆幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

图3 不同浓度钴处理下蚕豆幼苗光合特性参数的变化Fig．3 The broad bean seedling photosynthetic parameters with different Co concentrations

图4 不同浓度钴对蚕豆幼苗叶绿素荧光参数的影响Fig．4 Effects of different Co concentrations on broad bean seedling chlorophyll fluorescence parameters

图5 不同浓度钴处理下蚕豆幼苗叶片抗氧化酶活性的变化Fig．5 The broad bean seedling antioxidant properties with different Co concentrations

POD、SOD 和CAT 都是酶促防御系统的重要抗氧化酶，能有效防御活性氧或其他过氧化自由基对细胞膜系统的伤害，抑制膜脂过氧化，以减轻胁迫活性氧对植物细胞膜结构和功能的破坏，其活性变化与植物体内氧化胁迫有直接关系，常作为衡量植物抗逆性强弱的指标之一［15－19］。从图5可以看出，随着土壤中钴浓度增加，蚕豆叶片中POD、SOD和CAT 活性值均呈先升高后下降的变化趋势，并均在40mg·kg－1浓度钴处理时达到最大值。其中，3个抗氧化酶活性均在20和40mg·kg－1条件下高于相应对照，而均在80和120 mg·kg－1条件下低于对照，并在120mg·kg－1浓度条件下达到显著水平（P＜0．05）。这说明低浓度（20和40mg·kg－1）钴胁迫能诱导蚕豆体内主要抗氧化酶活性上升，有效清除胁迫引起的过量积累的活性氧，维持活性氧代谢平衡，减轻活性氧及自由基对叶片细胞膜的过氧化伤害，此时植株叶片受到钴的毒害作用不明显；而当钴浓度达到120mg·kg－1时，蚕豆体内抗氧化酶系统活性已显著降低，细胞内活性代谢失衡，活性氧大量积累，叶片细胞膜受到过氧化伤害，植株叶片受到钴的毒害作用明显加重。

3 讨 论

3．1 不同钴浓度处理下蚕豆幼苗生长和钴富集分布特征

根长、株高和生物量是植物最基本的生长指标，是评估逆境胁迫程度和植物抗逆能力的重要标准。大量研究表明，植物生长在逆境条件下会受到抑制，且胁迫程度越高受抑制现象越明显。本实验中蚕豆幼苗的根长、株高和生物量总体上随着钴浓度的增加先升高后降低，即低浓度钴处理对蚕豆幼苗生长具有显著促进作用，而高浓度钴处理则表现出对生长的显著抑制作用。

植株的生长与其自身对重金属的富集和分布特征密切相关。本研究中蚕豆各部分组织器官中钴的富集吸收量与土壤中钴含量呈正相关，即随着钴处理浓度的升高而增加；各器官对钴的积累吸收量分布规律为：根＞叶＞茎，这可能与钴在根、茎、叶中的运输机制不同有关。重金属在植株根部运输是在根共质体内运输，茎部运输是在木质部内运输，叶内运输是在跨叶细胞的液泡膜间运输［20］。可能原因是相同钴浓度条件下，根的运输机制更加活跃；随着钴浓度的增大，钴在茎部和叶部运输受到的抑制作用更加明显，所以根部吸收量在不同钴浓度处理间存在显著性差异，而茎和叶间差异不显著。

3．2 不同钴浓度处理下蚕豆幼苗叶片光合作用特征

光合作用是植物生长和干物质积累的基础，钴对蚕豆生长的抑制首先表现在对其光合作用的抑制上。首先，光合色素含量是影响光合作用速率的重要因素。本研究发现蚕豆幼苗叶片中的光合色素含量随着钴浓度的增加呈现先升高后降低的变化趋势，这与本实验室先前报道的钴对油菜的生长呈现低促高抑的现象一致［21］。有研究表明高浓度的重金属胁迫会显著抑制植物对合成叶绿素所需钙、铁、镁等元素的吸收，从而抑制了叶绿素合成，使得叶片表现出显著的缺素症状［22］。本研究中40 mg·kg－1以下的低浓度钴显著促进蚕豆叶片叶绿素含量的增加，表现出了低剂量的刺激效应［23］；而高浓度钴可能会抑制植物对铁、镁的吸收，从而抑制了叶绿素的合成，相关机理还需要进一步研究。

其次，净光合速率（Pn）是反映植物光合作用效率的重要指标。在逆境胁迫下，Pn往往会显著下降［24］，导致Pn下降的原因很多，包括叶绿素含量、叶片气孔导度、光合作用关键酶以及类囊体膜上光合膜蛋白的光化学转化效率等，可以分为气孔因素和非气孔因素两大类［25］。先前有研究表明，黑麦草在高浓度铬胁迫下气孔的关闭是净光合速率下降的主要原因［22］。本实验中蚕豆叶片叶绿素a、b含量在钴浓度为40～120mg·kg－1时受到抑制，吸收光能减少，影响了其光能的吸收和利用；叶片气孔导度、胞间CO2浓度在钴浓度为80～120 mg·kg－1时受到抑制，可能是由于气孔限制引起的浓度降低，进而二氧化碳同化能力下降；代表PSⅡ原初光能转化效率反映光抑制程度的Fv／Fm在40～120mg·kg－1时受到抑制，再结合保护酶SOD、POD 及CAT活性的变化趋势，说明在钴浓度为80～120 mg·kg－1时PSⅡ反应中心受到不可逆破坏，光合酶的活性降低，光反应中心光能转换、电子传递、光能磷酸化和光合作用暗反应等一系列过程受到抑制，导致Pn降低。

再次，叶绿素荧光是光合作用的探针，已被广泛应用于研究植物抗逆境生理［26］。在植物遭受胁迫时，光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学量子产量（Fv／Fm）通常会显著下降，其下降的幅度同植物受逆境伤害的程度显著正相关，因而Fv／Fm常被用来反映植物受逆境胁迫程度［27］。本实验中钴浓度大于40 mg·kg时，Fv／Fm值开始显著下降，说明叶片PSⅡ开始受到胁迫。同时，反映PSⅡ潜在活性的Fv／F0也是随钴浓度增加先上升后下降，说明低浓度的钴有利于蚕豆叶片的光合作用，而高浓度的钴则抑制蚕豆PSⅡ的潜在活性，且Fv／F0相较对照组下降幅度比Fv／Fm更大，说明Fv／F0比Fv／Fm能更准确反映蚕豆叶片PSⅡ对钴胁迫的敏感性。

3．3 不同钴浓度处理下蚕豆幼苗抗氧化酶活性的变化特征

SOD、POD 及CAT 是细胞抵御活性氧伤害的酶保护系统，在清除超氧自由基、控制膜脂过氧化作用、保 护 细 胞 膜 正 常 代 谢 方 面 起 重 要 作 用［28－29］。SOD、POD 和CAT 具有协同作用特点，从而有效清除植株体内过多的自由基，提高植株耐受胁迫的能力［30］。通过分析发现，随着钴处理浓度的增大，本研究中蚕豆叶片SOD、CAT、POD 活性均先逐渐增强后又减弱，说明在低浓度钴处理下蚕豆叶片能通过增强自身保护酶活性来抵御钴对其所造成的伤害。其中，从CK 到40mg·kg－1钴处理，蚕豆叶片中3种保护酶活性均逐渐增大，能有效清除活性氧，降低了钴胁迫对细胞膜的膜脂过氧化水平，通过调节自身的保护酶活性来保护其内部组织，防止其受到由于活性氧积累带来的伤害；随着钴浓度的继续增大，3种酶活性开始下降，在80mg·kg－1时已经低于CK 值，至120mg·kg－1时已显著下降，说明此时蚕豆生长已经受到了严重的钴胁迫伤害。SOD、POD 和CAT 值的变化说明了低浓度钴对蚕豆生长有诱导促进作用，而高浓度钴对其生长有胁迫伤害作用，进一步验证了陆宇等［3］的观点。

综上所述，蚕豆在不同浓度钴处理下，其根、茎、叶均可积累一定量的钴，且根的积累量最大；其叶片的光合色素含量、净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳、蒸腾速率、PSⅡ最大光化学量子产量和PSⅡ潜在活性等光合作用参数均表现为低浓度促进而高浓度抑制的现象，从而使蚕豆植株的根长、株高和生物量3个生长指标也表现出相似的变化趋势；蚕豆叶片主要抗氧化酶活性等指标也均表现为低浓度促进和高浓度抑制的现象。所以，钴对蚕豆植株生长发育和叶片光合效率的整体效应表现为低促高抑，而同期叶片主要保护酶活性的相似变化可能是其耐受钴胁迫的机制之一。

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