血栓通改善脑血管内皮细胞缺氧损伤的作用机制

徐春燕

四川广元市精神卫生中心神经内科 广元 628000

血栓通改善脑血管内皮细胞缺氧损伤的作用机制

徐春燕

四川广元市精神卫生中心神经内科 广元 628000

目的 探讨血栓通在改善脑血管内皮细胞缺氧损伤的作用机制。方法 选择在体外培养的人脐静脉血管内皮细胞为研究对象，分为对照组（正常内皮细胞组）、血栓通组（血栓通＋正常内皮细胞组）、缺氧组（模拟缺氧内皮细胞）和缺氧血栓通组（血栓通＋模拟缺氧内皮细胞）。采用CCK－8试剂盒观察各组内皮细胞的活性，通过流式细胞仪分析内皮细胞的凋亡情况。结果 与对照组比较，应用血栓通培育内皮细胞后，随着时间的推移，内皮细胞活性呈明显上升趋势；而与血栓通组比较，缺氧组内皮细胞活性明显下降；在血栓通干预后各个时间点的细胞活性逐渐增加，以24h效果最显著。与常规缺氧对照组比较，缺氧血栓通组内皮细胞的凋亡率显著降低，而缺氧诱导因子抑制HIF的表达后，缺氧内皮细胞的凋亡率显著升高，最后在血栓通处理后，其内皮细胞的凋亡率显著较血栓通未处理的缺氧诱导因子抑制组明显降低。结论 血栓通可以明显提高缺氧血管内皮细胞活性，当内皮细胞处于持续缺氧状态时，还可以抑制内皮细胞的凋亡，具体的分子机制有待进一步研究。

血栓通；脑血管内皮细胞；缺氧损伤；作用机制

缺血性脑卒中是临床上非常常见的一类疾病，最常见的有短暂性缺血发作、急慢性脑梗死等［1］。然而，在不同程度的缺血发病机制过程中，必然存在一定的缺氧［2］。临床研究发现，缺氧诱导因子在缺血性脑血管病变中发挥保护作用，可以促使缺氧内皮细胞产生一种缺氧适应，一定程度抑制了疾病的进展［3］。血栓通是临床上较为常见的一种治疗缺血性脑血管病的中成药制剂，临床疗效显著，而对其具体作用机制的研究仍较少。我院研究了血栓通在改善脑血管内皮细胞单纯缺氧损伤的作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）人脐静脉血管内皮细胞购于上海拜力生物科技有限公司细胞库。（2）主要试剂：血栓通超微粉由我院研制（100701），贮存液的配制：称取一定量血栓通超微粉溶解于无血清DMEM培养基中，超声波溶解1h，3 600r／min，离心10min，取上清液，过滤除菌，将剩余沉淀物于60℃条件下加热烘干，计算血栓通实际溶解浓度，制备成2 000mg／L血栓通超微粉备用。

1.2 方法

1.2.1 分组：①对照组（正常内皮细胞组）：正常条件下进行培养；②血栓通组（血栓通＋正常内皮细胞组）：加入含通心络超微粉（终浓度为100mg／L）联合正常内皮细胞正常条件下进行培养；③缺氧组（模拟缺氧内皮细胞）：95%N2＋4%CO2＋1%O2条件下培养内皮细胞；④缺氧血栓通组（血栓通＋模拟缺氧内皮细胞）：加入含通心络超微粉（终浓度为100mg／L）联合95%N2＋4%CO2＋1%O2条件下培养的内皮细胞。

1.2.2 细胞活性的测定：操作严格CCK－8试剂盒说明书检测试剂各组内皮细胞分别于缺氧0h、12h、24h、48h后测定细胞活性，通过流式细胞仪分析内皮细胞的凋亡情况。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0进行数据统计，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组内皮细胞活性改变比较 与对照组比较，血栓组随着时间的推移，内皮细胞活性呈明显上升趋势；与血栓通组比较，缺氧组内皮细胞活性明显下降；在血栓通干预后各个时间点的细胞活性逐渐增加，以24h效果最显著。见表1。

表1 各组内皮细胞活性改变情况比较 （±s）

表1 各组内皮细胞活性改变情况比较 （±s）

注：与对照组比较，＊P＜0.05；与缺氧组比较，＃P＜0.05；与对照组比较，＊＊P＜0.01

组别0h12h24h48h对照组1.101±0.046 8.201±0.432 8.299±0.465 8.899±0.547血栓通组1.097±0.043 8.983±0.451 10.012±0.511 12.013±0.997缺氧组1.100±0.045 6.245±0.409＊6.198±0.439＊5.224±0.325＊＊缺氧血栓通组1.098±0.047 7.778±0.460 8.301±0.558＃6.338±0.361

2.2 缺氧诱导因子对内皮细胞凋亡的影响 与常规缺氧对照组比较，缺氧血栓通组内皮细胞的凋亡率显著降低，而缺氧诱导因子抑制HIF的表达后，缺氧内皮细胞的凋亡率显著升高，在血栓通处理后，其内皮细胞的凋亡率较血栓通未处理的缺氧诱导因子抑制组明显降低。见表2。

表2 缺氧诱导因子对内皮细胞凋亡的影响 （±s）

表2 缺氧诱导因子对内皮细胞凋亡的影响 （±s）

注：与常规缺氧组比较，＊P＜0.05；与缺氧诱导因子抑制组比较，＃P＜0.05；与常规缺氧组比较，＊＊P＜0.01，与缺氧诱导因子抑制组比较，＃＃P＜0.01

组别0h12h24h48h缺氧组1.035±0.061 13.552±1.632 21.997±1.876 31.9 44.729±2.973 99±2.671缺氧血栓通组1.029±0.055 8.001±0.523＊＊8.445±0.583＊＊15.446±1.042＊＊缺氧诱导因子抑制组1.033±0.057 21.003±1.980＊29.225±2.345＊＊46.571±3.004＊＊缺氧血栓通诱导因子抑制组1.032±0.056 14.329±1.231＃＃24.374±2.003＃

3 讨论

血栓通在临床上应用较广泛，主要成分三七总皂苷，具有活血祛瘀、扩张血管、改善血液循环的作用，在临床治疗脑血管缺血性疾病方面有很好的临床疗效［4］。而有关血栓通在改善脑血管内皮细胞的作用机制相对甚少［5］。而脑血管缺血性疾病的具体发病机制不明，但许多相关研究表明持续缺血造成的缺氧在介导疾病进展方面发挥了重要作用。脑血管缺血缺氧性疾病患者中存在一种缺氧诱导因子［6－7］，其在细胞浆中稳定表达，而HIF－1α亚基在翻译后即被泛素－蛋白酶水解复合体降解。因此，在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到亚基的表达，而在缺氧状态下，仅亚基的降解被抑制，1α和β亚基形成有活性的HIF－1，转移到细胞核内调节多种基因的转录。它可以编码促红细胞生成素基因，血管内皮生长因子基因、胰岛素样生长因子Ⅱ基因、内皮素－1、血小板源性生长因子、葡萄糖载体蛋白1、3和糖酵解酶，包括醛缩酶A、烯醇化酶1、乳酸脱氢酶A、磷酸果糖激酶L、磷酸甘油酸激酶1、己糖基酶，2、3－磷酸甘油醛脱氢基因等，参与调解缺氧耐受反应［8－9］。

血栓通在治疗脑血管缺血性疾病方面是否可以对缺氧机制产生一定的抑制作用引起了我们的重视，故我院开展了血栓通在改善脑血管内皮细胞缺氧损伤的作用机制探讨，结果发现：（1）与对照组比较，应用血栓通培育内皮细胞后，随着时间的推移，内皮细胞活性呈明显上升趋势；而与血栓通组比较，缺氧组内皮细胞活性明显下降；在血栓通干预后各个时间点的细胞活性逐渐增加，以24h效果最显著。血栓通可以明显提高缺氧内皮细胞的活性，促进其缺氧耐受。（2）与常规缺氧对照组比较，缺氧血栓通组内皮细胞的凋亡率显著降低，而缺氧诱导因子抑制HIF的表达后，缺氧内皮细胞的凋亡率显著升高，最后在血栓通处理后，其内皮细胞的凋亡率显著较血栓通未处理的缺氧诱导因子抑制组明显降低。另外，血栓通可以明显降低缺氧内皮细胞的凋亡，减少细胞快速坏死。这些作用机制可能与血栓通对于缺血诱导因子的调节有关，一方面上调缺血诱导因子；另一方面可能发挥了缺血诱导因子抑制内皮细胞凋亡［10］。

综上所述，血栓通可以明显提高缺氧血管内皮细胞活性，当内皮细胞处于持续缺氧状态时，还可以抑制内皮细胞的凋亡，具体分子机制有待进一步研究。

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（收稿2014－12－18）

The mechanism exploration of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells

Xu Chunyan
Department of Neurology，the Guangyuan Psychiatric Health Center，Guangyuan62800，China

Xueshuantong；Cerebral vascular endothelial cells；Hypoxic injury；Mechanism

R743

A

1673－5110（2015）24－0014－03

【Abstract】Objective To explore the mechanism of how Xueshuantong improving the function of hypoxia－injured cerebral vascular endothelial cells.Methods The cultured human umbilical vein endothelial cells in vitro were selected as research subjects，which were divided into the control group（only including normal endothelial cells），Xueshuantong group（normal endothelial cells＋Xueshuantong），hypoxia group（simulated hypoxic endothelial cells）and hypoxia Xueshuantong group（Xueshuantong＋stimulated hypoxic endothelial cells）.The endothelial cell activity of all groups was observed using the kit uses CCK－8，and the condition of endothelial cell apoptosis was analyzed by flow cytometric method.Results Compared with the control group，as time went on，the activity of endothelial cells was gradually increased following the Xueshuantong application to the cultivation of endothelial cells.Hypoxia group decreased the activity of endothelial cells，which were advanced at each point after the Xueshuantong intervention and peaked at 24hours.Compared with hypoxia group，hypoxia Xueshuantong group had obviously lower apoptosis rate of endothelial cells，which was markedly elevated after the inhibitory expression of HIF by hypoxia－inducible factors，and was increased once again after Xueshuantong intervention finally.As noted，the apoptosis rate was significantly lower than that before Xueshuantong intervention.Conclusion Xueshuantong can significantly improve the activity of injured vascular endothelial cells induced by hypoxia，and can inhibit the cell apoptosis when under the state of continuous hypoxia.The specific molecular mechanism remains to be investigated further.