甜瓜坏死斑点病毒研究进展

吴会杰　古勤生

摘 要： 甜瓜（Cucumis melo）是世界上熱带和温带地区的一种重要葫芦科作物，也是我国重要的经济作物，甜瓜感染甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）会造成重大经济损失。本文对甜瓜坏死斑点病毒的分类地位、特性及发生分布、基因与致病性研究、病毒在细胞间的运动、影响传播因素及抗性研究等进展做一综述。目前，关于该病毒的研究国内外已有不少报道，但病毒致病机制的研究仍在探索，因此揭示其致病机制成为研究该病毒的首要任务，为该病毒的抗性研究奠定基础。

关键词： 甜瓜； 甜瓜坏死斑点病毒； 分类地位； 致病性

Abstract： Cucumis melo is one of the important Cucurbitaceae in the tropical and temperate regions and also a major economic crop in our country. Melon necrotic spot virus（MNSV） cause significant economic losses in melon. The taxonomic status，characteristics and distribution，analysis of genes and pathogenicity，virus cell-to-cell movement and influence factor of transmission and resistance of MNSV were reviewed. Although there were many researches on MNSV，but there are few reports on the virus pathogenic mechanism. Therefore，it is necessary to find the host factors related to the virus and reveal the pathogenicity mechanisms of MNSV.

Key Words： Cucumis melo； Melon necrotic spot virus； Taxonomic status； Pathogenicity

甜瓜（Cucumis melo）是世界上热带和温带地区的重要葫芦科作物，也是我国重要的经济作物，感染甜瓜坏死斑点病毒（Melon necrotic spot virus，MNSV）会造成重大经济损失。该病毒在世界范围内广泛发生，我国主要在江苏省海门市和山东省寿光市发生，国内外对MNSV已有不少的研究，本文综述了甜瓜坏死斑点病毒的分类地位、特性及发生分布、基因与致病性研究、病毒在细胞间的运动、影响传播因素及抗性研究等进展，并展望了该领域未来的研究方向。

1 分类地位、特性与发生分布

MNSV属于香石竹斑驳病毒属（Carmovirus），粒体为球形，直径约30 nm。基因组为正义单链RNA，约4.3 Kb，5端不含帽子结构且3端不含poly（A）结构，编码5个开放阅读框。主要通过种子、土壤中的真菌瓜油壶菌（Olpidium bornovanus）和黄瓜黑头叶甲进行自然传播，另外还可以通过机械磨擦接种进行传播。其寄主范围仅限于葫芦科的一些植物，例如甜瓜[1]、黄瓜[2]、西瓜[3]、南瓜及葫芦等。在甜瓜上引起的症状有：叶片、叶柄和茎上出现坏死斑或者褪绿斑（图1），植株矮化，果实变小，严重影响作物的品质和产量，随着种子产业的发展，该病害随种子调运远距离传播将会严重影响我国甜瓜生产。日本最先报道MNSV侵染甜瓜[1]，其次为美国加利福尼亚[4]、希腊[5]、意大利[6]、突尼斯[7]及中国[8-9]等。

2 MNSV基因及侵染性克隆

已报道的MNSV分离物很多，其病毒基因序列有很高的一致性，如日本分离物-NH和-S的CP氨基酸序列一致性超过95%[10]，-NH和-NK核苷酸和氨基酸一致性是97.4%～99.5% 和 97.7%～100%。虽然序列一致性很高，但其致病力强弱却有很大区别，-NK分离物不能系统侵染甜瓜，推测其运动蛋白7A的丝氨酸与系统侵染有关[11]。-YS和-KS甜瓜分离物比-NH致病力强，易引起植株生长受阻[12]。-W西瓜分离物在甜瓜上不表现症状，可能与其缺乏细胞间的运动有关[13]。国内也研究了MNSV-HM分离物的全长基因序列，MNSV-HM分离物的氨基酸与MNSV-264的一致性达到98.1%[14-15]。

RNA病毒侵染性克隆的建立，使重组DNA技术及其他相关技术在研究中的应用成为可能，从而克服了RNA病毒难以进行遗传操作的问题。MNSV在侵染性克隆方面的研究也有不少：成功构建-Ma5和-A1等分离物的侵染性克隆[16-17]，并在侵染性克隆的基础上进行了-A1的突变及GFP重组[17]；Usami等[18]的研究表明p29的大片段同义突变导致了MNSV致病性的缺失，Mochizuki等[19]的研究表明p29与线粒体内膜有关且是引起枯斑的致病因子，免疫杂交和免疫共定位试验表明细胞中正义链病毒RNA、cp蛋白和（ds）RNA的定位意味着病毒的复制与线粒体有关，而p29的瞬时表达揭示了它特有的靶标是线粒体[20]。

3 病毒在细胞间的运动

植物病毒侵入寄主细胞后，病毒侵入植株并移动产生系统侵染需要2个基本的路径：经过叶肉细胞胞间连丝来实现的胞间转运和经过维管系统的韧皮部筛管来实现的长距离转运。细胞间的移动是从最初侵染的细胞移动到维管束鞘，然后通过维管束组织（通常为韧皮部筛管）进行长距离运输，最后通过进一步的细胞间移动而建立对幼嫩叶片的侵染[21]。植物病毒胞间转运过程大多受到病毒移动蛋白（movement protein，MP）调控，不同MP对病毒转运有不同的路径和机制[22]。MNSV在寄主植物体内的转运机制也有不少相关研究。MNSV细胞间运动是由7A和7B控制的[23]。7A突变体及融合荧光蛋白GFP定位揭示了7A RNA结合区域是MNSV进行细胞间运动所必须的[24]。7B包含一个疏水区域并结合到内质网膜及Nt/Ct结构域，参与病毒细胞内或细胞间移动的分泌途径，与荧光蛋白融合的7B通过内质网定位在积极跟踪肌动蛋白微丝的高尔基体和胞间连丝上[25]。7B也是一个跨膜结构，其结构模式为内质网膜—高尔基体—胞间连丝（ER—GA—Pd）。7B突变体揭示了移动蛋白的结构与MNSV在细胞间移动的关系，跨膜区附近的侧翼区域能显著地减少MNSV在细胞间的移动；膜的插入对7B在细胞间移动起到很重要的作用。因此，MNSV细胞间的移动需要7B有秩序地转运，通过内质网膜，依赖COPII的高尔基途径达到高尔基体，最后到达胞间连丝，完成病毒在细胞间的运动[26-27]。

4 影响传播的因素

环境对植株生长的影响很大，其中温度是关键因子之一，温度改变对MNSV接种后植株的表现症状影响非常大。MNSV在日本的发生主要从冬季到第2年的初夏，夏季很少发生。在15、20、25 ℃ 3个温度下，甜瓜接种MNSV 7 d后，15 ℃不产生系统症状，20 ℃出现系统症状比例为20%，25 ℃有10%产生系统症状；接种14 d后，15 ℃出现系统症状的达到30%，20 ℃达到50%，25 ℃则只有10%；接种21 d后，15 ℃产生系统症状的甜瓜苗达到90%，20 ℃出现80%，25 ℃表现低于20%，在25 ℃保持的许多甜瓜苗，虽然接种子叶的部位表现出典型的枯斑，但上部的真叶几乎很少出现枯斑，表明MNSV的系统侵染与温度有关。温度变化试验表明，当20 ℃培育14 d随后转移至25 ℃条件时，MNSV发生率降低了31.3%；而当25 ℃培育14 d随后转移至20 ℃的条件时，MNSV发生率提高到68.8%，证实了MNSV的发生率与植株生长温度有关[28]。当甜瓜植株在15 ℃条件时，隐性抗性基因nsv的抗性能被MNSV-Chiba分离物打破。在15 ℃和20 ℃ 条件下，病毒RNA在抗性品种的原生质里积累。摩擦接种子叶的甜瓜在15 ℃能在真叶上系统发生，但20 ℃条件下却不能在真叶发生。因此，在低于20 ℃条件下，在甜瓜的抗病品种中的抗病基因nsv发生温敏失活[29]。温度变化对MNSV系统侵染的影响表明MNSV是温度敏感型病毒，因此研究MNSV的致病机制时，温度是必须要考虑的问题，MNSV的温敏机制也是研究MNSV致病机制的核心问题。本课题下一步的计划是在现有MNSV基因功能研究的基础上，利用分子生物学手段，结合侵染性克隆和突变体的构建，探寻不同温度对病毒在植物体内存在状态及MNSV在植物体内的复制、转运及表达情况的影响，期望揭示温度对甜瓜坏死斑点病毒系统侵染的分子机制。

MNSV的传播除了温度之外，传播介体的影响也不可忽视。研究表明所有的油壶菌在黄瓜、甜瓜和西葫芦上都具有传播MNSV的能力[30]，且油壶菌是MNSV种传的辅助工具[31]，该病害的发生与油壶菌存在相关[32]。油壶菌不存在时，种子携带的病毒不能传播到幼苗，在油壶菌的辅助下其病毒的种传率在0.1%～5.3%[31]。研究表明，MNSV cp基因的氨基酸Ile 变为Phe导致在油壶菌表面不能检测到MNSV，但病毒粒子在组装和生物学方面未受影响。因此推测MNSV cp基因与油壶菌的传播有关。-Chi和-W株系分别由油壶真菌Y1 和 NW1传播，但-Chi不能由NW1传播，反之Y1也不传播-W株系。比较了2种不同分离物cp基因的差异及其三维结构，发现不同分离物病毒粒子表面许多氨基酸残基存在差异，是油壶真菌不能有效传播的原因[33]。此外，在水中也能检测到MNSV[34]。目前，根据MNSV和传播介体油壶真菌的地理分布，遗传多样性及亲缘关系，MNSV被分为为欧美洲组，日本甜瓜组和日本西瓜组[35]。对MNSV带毒种子的处理也有研究。用烘干处理和堆肥发酵处理2种方式处理MNSV侵染后的病残体，烘干处理能减少MNSV的侵染性；堆肥最高的温度可以达到61.9～73.8 ℃，堆肥处理30 d极少能检测到病毒的侵染[36]。MNSV苗期检测其传毒率至少为7%～8%，其种子的带毒率为11.3%～14.8%。70 ℃处理144 h能有效减少MNSV且不影响种子萌发[37]。这些研究成果都为健康种苗的获得提供了理论指导，为甜瓜产业的发展奠定了基础。

5 MNSV抗性基因标记及抗性分析

基因是控制抗性的一个重要因素。MNSV抗性是单个隐性基因控制的，该隐性基因在甜瓜基因组11连锁群上，并建立了17.7 cM的连锁距离[38]。进一步扩大F2和BC1群体，建立3.2 cM的标记，在BAC中找到了覆盖遗传距离0.73 cM的标记，为nsv隐性基因的定位奠定了基礎[39]。目前，nsv隐性基因已经引入商业品种中，表现出了很强的抗MNSV的性状[40]。‘Doublon接种MNSV不产生系统侵染症状，因此用抗病品种‘Doublon和感病品种‘ANC-42杂交系分析表明显性基因Mnr1和Mnr2控制这种抗性，定位到19 cM上[41]。

3-UTR序列在打破寄主抗性方面有重要的作用。-264株系能打破寄主抗性和侵染非寄主植物千日红，推测该抗性可能是3-UTR区的序列不同引起的[42]。随后把-Ma5和-264的3-CITE序列互换，证实打破其寄主抗性主要是3-CITE区[43]。进一步的研究表明-264能克服隐性基因和烟草的非寄主抗性，其主要是3-UTR区的一段49 bp的碱基，-Ma5的3-CITE与-264不同，在烟草中不能启动有效地翻译而阻止了病毒复制基因的表达；如果来源于感病寄主的eIF4E被表达，MNSV-Ma5就能在烟草中复制，表明烟草对-Ma5的抗性是由于3-CITE和eIF4E间的对立引起的[44]。-N能克服eIF4E介导的抗性，分析其序列发现在3-UTR存在一段55 bp的序列，该序列来自于南瓜蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）的种间重组[45]。3-UTR序列在病毒研究中的作用越来越重要，因此在未来的工作中还会有其他的作用被挖掘。分析比较了被MNSV侵染的甜瓜和健康的甜瓜韧皮部蛋白质之间的差异，共鉴定了19个差异蛋白[46]。病毒入侵与寄主防御是一个长期的进化过程，寻找与病毒互作的寄主因子，揭示病毒的致病机理，分析其在寄主体内如何生长繁殖，为控制该病害的发生发展奠定了基础。

6 问题与展望

植物病毒学的研究目标是搞清病毒的特性，鉴定侵染过程中寄主与植物如何互作，明确寄主抗病（或感病）及病毒致病的机制，最终控制病毒的危害。目前，关于该病毒的研究国内外已有不少报道，但病毒致病机制和沉默抑制子的研究仍在探索阶段，因此揭示其致病机制和沉默抑制子成为该病毒的未来的研究方向。

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