磁性微球固定化啤酒废酵母吸附重金属铅

朱丽英，晏晓琴，凌敏洁，张红漫，江凌

（1.南京工业大学理学院，江苏南京 210009；2.南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京 210009）

磁性微球固定化啤酒废酵母吸附重金属铅

朱丽英1，晏晓琴1，凌敏洁1，张红漫1，江凌2

（1.南京工业大学理学院，江苏南京 210009；2.南京工业大学食品与轻工学院，江苏南京 210009）

以壳聚糖和海藻酸钠为主要包裹材料制备了固定化啤酒废酵母磁性微球，考察了海藻酸钠浓度对微球成型和机械强度的影响，比较了固定化啤酒废酵母磁性微球和游离废酵母对重金属Pb2+的吸附能力，采用重复批次吸附实验研究了固定化啤酒废酵母磁性微球的吸附稳定性。结果表明，固定化啤酒废酵母磁性微球对Pb2+的吸附能力远远高于游离废酵母。扫描电镜照片表明固定化啤酒废酵母磁性微球的内部环境非常有利于酵母细胞的高密度附着，15批次的重复吸附实验证明了磁性微球固定化的酵母细胞能长时间维持较高的活性。

啤酒废酵母；磁性微球；固定化；铅离子

重金属污染是当今最重要的环境问题之一，其中铅（Pb）是一种性质稳定、分布广、有蓄积性的重金属类环境污染物。铅及其化合物可以通过消化道、呼吸道进入人体，在人体内半衰期长，对多个器官都有一定危害，尤其对儿童脑部发育有较大危害。在铅污染越严重的地方，儿童智力低下的发病率越高；儿童的血铅水平每上升100μg·L－1，其智商（IQ）要下降6～8分。生物吸附法是处理大体积低浓度重金属污染的一种理想方法，近年来逐渐成为研究热点［1-2］。研究发现，酿酒酵母不仅是具有实用潜力的生物吸附剂，也是研究重金属生物吸附机理的良好材料［3-4］。酵母具有无毒性、易生长的特点，被称为GRAS（generally regarded as safe）生物，用于污染治理易于为公众所接受；并且，成熟的大规模工业生产使得酿酒酵母成为最廉价的工业微生物；此外，酵母是生物学研究中的一种理想模式生物，研究酵母与重金属的相互作用，易于在分子水平上深入探讨其对重金属的生物吸附机理，并可为其它生物体与重金属的相互作用提供参考。

利用啤酒发酵工业产生的废酵母作为吸附材料，不但可以降低重金属污染处理的成本，同时也能提高企业的经济效益。然而，采用啤酒废酵母吸附重金属存在收集困难、难以重复利用等缺点；而以壳聚糖和海藻酸钠等天然高分子为包裹材料，与磁性材料相结合制备固定化酵母磁性微球有望解决上述问题。壳聚糖和海藻酸钠均是无毒、生物相容性好、可生物降解的生物质材料，两者通过静电相互作用形成微囊［5］。磁性材料的应用使得制备的聚电解质微球能够在外加磁场的作用下迅速分离，达到回收利用的目的，且操作简便、价格低廉。

作者以磁性微球包埋的啤酒废酵母作为重金属Pb2+的吸附剂，分析了海藻酸钠浓度对磁性微球的成型和机械强度的影响，比较了磁性微球固定化的啤酒废酵母和游离废酵母对重金属Pb2+的吸附能力差异，并采用重复批次吸附实验研究了固定化啤酒废酵母磁性微球的吸附稳定性。

1 实验

1.1 材料、试剂、培养基及仪器

啤酒废酵母（Saccharomyces cerevisiae），南京金陵啤酒厂。

海藻酸钠、壳聚糖，国药集团化学试剂有限公司；硝酸铅，重庆昌宥科技有限公司；氯化钙，西陇化工股份有限公司。所用试剂均为分析纯。

Fe3O4纳米颗粒，市售。

YPD液体培养基：2%蛋白胨，1%酵母浸粉，2%葡萄糖。

SPX-150-Z型摇床，上海跃进医疗器械公司； LXT-2型离心机，上海医用分析仪器厂；SBA-40C型SBA生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；FEI QUANTA200F型扫描电子显微镜，美国；QTS-25型质构仪，美国Brookfield公司。

1.2 方法

1.2.1 海藻酸钠浓度的确定

分别配制不同浓度（5 mg·L－1、10 mg·L－1、15 mg·L－1、20 mg·L－1、25 mg·L－1、30 mg·L－1）的含0.2 g Fe3O4颗粒的海藻酸钠溶液20 mL，转移至20 mL医用注射器中，滴入到50 mL含1%（mg/100 mL，下同）CaCl2的10 mg·L－1壳聚糖溶液中，观察成球情况，并做机械强度实验，采用质构仪进行挤压，使其变形，记录所使用的力。从成球情况、制备的难易程度和机械强度等方面来确定海藻酸钠的最佳浓度。

1.2.2 磁性微球及固定化酵母磁性微球的制备［5］

磁性微球的制备：称取Fe3O4颗粒1.0 g，加入到100 mL 20 mg·L－1的海藻酸钠溶液中混匀，用针管抽取一定量混合液，滴加至不断搅拌的含1%CaCl2的10 mg·L－1的壳聚糖溶液中，搅拌30 min。

菌悬液的制备：挑取一环酵母菌接入100 mL YPD液体培养基中，25℃恒温摇床振荡培养24 h。培养物3 000 r·min－1离心5 min，收集沉淀，用无菌生理盐水配成浓度为0.1 g·mL－1的菌悬液。

酵母菌的包埋和活化：取1mL菌悬液与20mL 20 mg·L－1海藻酸钠溶液混合，再加入0.5%Fe3O4纳米颗粒搅拌均匀后，转入20mL注射器中，滴加至不断搅拌的10 mg·L－1的壳聚糖溶液中，搅拌30 min。得到直径为3～5 mm的固定化小球。4℃冰箱过夜后，用无菌生理盐水洗涤2～3次，接入50 mL YPD液体培养基进行活化培养。25℃活化24 h后，换新鲜YPD液体培养基，继续活化24 h，置4℃冰箱备用。

1.2.3 游离酵母与固定化酵母磁性微球对Pb2+吸附能力的比较

取2mL 0.2mol·L－1的硝酸铅溶液分别加入到4份100 mL的YPD液体培养基（标记为1#、2#、3#、4#）中，其中1#、2#培养基中加入50颗固定化酵母磁性微球，3#、4#培养基中接入5 mL 0.1 g·mL－1的菌悬液，25℃恒温摇床振荡培养。分别在2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h取样5 mL，用EDTA法测Pb2+浓度。

1.2.4 固定化酵母磁性微球的重复批次吸附实验

将固定化酵母磁性微球100颗接入100 mL YPD培养基（含0.2 mol·L－1的硝酸铅溶液2 mL）中进行批式发酵。发酵条件为25℃恒温摇床培养。在前一个批次吸附反应结束后，采用磁铁吸附沉淀的方式收集固定化酵母磁性微球。将微球在100 mL的KNO3溶液中低速搅拌24 h，收集微球，添加新鲜YPD培养基，进行下一个批次的吸附实验，实验共进行15个批次，每个批次为10 h。用EDTA法测Pb2+浓度。

2 结果与讨论

2.1 海藻酸钠浓度对磁性微球制备成型的影响（表1）

表1 海藻酸钠浓度对磁性微球制备成型的影响Tab.1 Effect of sodium alginate concentration on the form ing ofmagneticm icrospheres

从表1可以看出，海藻酸钠浓度直接影响固定化酵母磁性微球的成型情况。海藻酸钠浓度太低，微球的包埋性能差，被固定化酵母细胞容易泄漏导致固定化功能失效；随着海藻酸钠浓度的增加，微球颗粒制备成型好，载体对细胞的包埋程度增强，但与此同时液体的黏度不断增大，微球制备难度加大，而且可能影响物质在微球颗粒内部的扩散，进而影响酵母菌的生长和发酵性能。因此，初步确定海藻酸钠最佳浓度为20 mg·L－1。

2.2 海藻酸钠浓度对磁性微球机械强度的影响（图1）

由图1可知，随着海藻酸钠浓度的增大，磁性微球的机械强度明显增大，浓度大于20 mg·L－1后，微球的机械强度增幅减缓。由于海藻酸盐由1，4-β-D-甘露糖醛酸（M段）和1，4-α-L-古罗糖醛酸（G段）两种结构单元通过α-1，4糖苷键连接成不同比例的GM、MM和GG组合，从而形成线性共聚物［6］。随着海藻酸钠浓度的增大，单位体积海藻酸钠分子数增加，与壳聚糖更易作用，长链之间也更容易堆砌缠结，因此海藻酸钠浓度增大可以使磁性微球硬度增大。综合微球成型和机械强度，确定海藻酸钠最佳浓度为20 mg·L－1。

图1 海藻酸钠浓度对磁性微球机械强度的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on mechanical strength ofmagneticm icrospheres

2.3 游离酵母与固定化酵母磁性微球对Pb2+的吸附曲线（图2）

图2 游离酵母与固定化酵母磁性微球对Pb2+的吸附曲线Fig.2 Adsorption curves of Pb2+of free and immobilized yeastmagnetic m icrospheres

由图2可知，固定化酵母磁性微球对Pb2+的吸附能力超出游离酵母15倍之多（30 000μmol·g－1vs.2 000μmol·g－1）。磁性微球固定化酵母对Pb2+的吸附量在约2 h后达到最佳，约6 h后吸附趋于饱和。这是由于，一方面，磁性微球内部呈网状结构，存在大量孔洞（图3），为酵母细胞的高密度提供了良好的微环境及传质传热条件；另一方面，由于磁性微球材料壳聚糖的分子中含有羟基和氨基活性基团，能与重金属离子配位形成络合物，与水溶液中的Pb2+产生络合作用，而海藻酸钠分子中含有大量游离的羧基，能够与金属离子发生反应，因此对Pb2+均具有一定的吸附作用［7］。同时，微球可使包埋的酵母细胞免受外界环境（如机械剪切力）的损伤，这在很大程度上延长了酵母的使用寿命。

2.4 磁性微球固定化酵母细胞的重复批次吸附实验（图4）

图3 磁性微球（a）和固定化酵母细胞（b）的扫描电镜照片Fig.3 SEM Images ofmagneticm icrospheres（a） and immobilized yeast cells（b）

图4 磁性微球固定化酵母细胞重复批次吸附实验Fig.4 Repeated batch adsorption experiment of magneticm icrospheres immobilized yeast cells

由图4可知，随着重复批次的增加，磁性微球固定化酵母细胞对Pb2+的吸附量保持稳中略降的趋势，第15批相比第1批的吸附量下降了30%左右。酵母吸附Pb2+的过程主要分为两个阶段：首先，Pb2+吸附到细胞表面，其特点是快速、可逆、不依赖于能量代谢；第二阶段，Pb2+穿透细胞膜进入胞内，以较慢的速度继续累积进入细胞，速度慢、不可逆、与能量代谢有关，最终被细胞正常的生长代谢所转化［8］。上述实验证实了磁性微球固定化的酵母细胞能长时间维持较高的活性。

3 结论

海藻酸钠浓度为20 mg·L－1时制备的壳聚糖/海藻酸钠磁性微球成球性好，形状、大小均匀，并且具有较高的机械强度。磁性微球固定化后的啤酒废酵母细胞对Pb2+的吸附能力远远强于游离酵母，并且重复使用15批次后，对Pb2+的吸附性能仍能保持70%以上，显示了良好的应用前景。

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Adsorption of Heavy M etal Lead w ith W aste Beer Yeast Immobilized in M agnetic M icrosphere

ZHU Li-ying1，YAN Xiao-qin1，LING M in-jie1，ZHANG Hong-man1，JIANG Ling2
（1.College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China； 2.College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

Themagnetic microspheres used to immobilize waste beer yeastwere prepared with chitosan and sodium alginate as themain packagematerials.Effects of sodium alginate concentration on the forming and mechanical strength ofmagnetic microspheres were investigated.The adsorption capactity of heavy metal lead ion with immobilized and free yeast cellswas further compared.In addition，repeated batch adsorption experimentwas used to test the adsorption stability ofmagnetic microspheres with immobilized waste beer yeast.The results showed that，the adsorption capacity of lead ion of immobilized yeast cells inmagneticmicrosphereswasmuch higher than thatof free yeast cells.SEM Images indicated that the internal immobilized environmentwas very conducive to the attachment of high density of yeast cells.The 15 batches of repeated adsorption experiment demonstrated that the immobilized yeast cells could maintain higher activity for a long time.

waste beer yeast；magnetic microsphere；immobilization； lead ion

X 703.1

A

1672-5425（2015）07-0018-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.005

江苏省自然科学基金资助项目（BK20131046，BK20130917），江苏省高校自然科学基金面上项目（14KJB530003），教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（20123221120011）

2015-03-19

朱丽英（1982－），女，湖南郴州人，博士，讲师，研究方向：生物化工；通讯作者：江凌，副教授，E-mail：jiangling@njtech.edu.cn。