自组装法制备CMCS／PEG纳米粒子及其pH值响应性研究

陈怀俊，贺继东，董慧慧

（青岛科技大学 橡塑材料与工程教育部重点实验室山东省橡塑材料与工程重点实验室，山东 青岛 266042）

自组装法制备CMCS／PEG纳米粒子及其pH值响应性研究

陈怀俊，贺继东，董慧慧

（青岛科技大学 橡塑材料与工程教育部重点实验室山东省橡塑材料与工程重点实验室，山东 青岛 266042）

以壳聚糖（CS）为原料与氯乙酸反应制备羧甲基壳聚糖（CMCS），再将聚乙二醇（PEG）和CMCS以不同的质量比溶解在不同pH值的溶液中，通过氢键相互作用自组装形成CMCS／PEG纳米粒子，并研究其粒径大小与二者配比和溶液pH值之间的关系。结果表明，不同配比下的粒子粒径均随pH值的增大先增大后减小；当pH＜5时，在相同pH值溶液中，随着PEG比例的增加，粒子的粒径先减小后增大，在pH＝1.22、PEG∶CMCS＝4∶1时粒径最小，约为160 nm；当pH≥5时，在相同pH值溶液中，粒径随PEG用量的增加而增大；通过自组装法制备的CMCS／PEG纳米粒子粒径大小具有pH值响应性。

壳聚糖；羧甲基壳聚糖；聚乙二醇；自组装；pH值响应；CMCS／PEG纳米粒子

壳聚糖（chitosan，CS）化学名称为（1，4）－2－氨基－2－脱氧－β－D－葡萄糖，属氨基多糖类，由甲壳素部分脱乙酰制得，具有良好的生物组织相容性和生物可降解性，被广泛应用于生物医药［1－3］、食品保健［4－5］、环境保护［6］等领域，但壳聚糖溶解性较差限制了其应用范围，尤其是在生物医学领域。为了改善壳聚糖的溶解性，进一步拓宽应用范围，将壳聚糖羧甲基化，制成羧甲基壳聚糖（CMCS），既保留了壳聚糖优良的物理化学性能，还具有很好的溶解性，是良好的生物医学材料［7－10］。吴友吉等［11］以DMSO－H2O为溶剂，在碱性条件下由壳聚糖与氯乙酸反应制备了CMCS，取代度为1.93，并探索出较适宜的制备条件为：壳聚糖1g，氯乙酸与壳聚糖质量比为5∶1，氢氧化钠质量分数35%，十六烷基三甲基溴化铵质量分数5%（均以壳聚糖质量计），在50℃下反应6h。

聚乙二醇（PEG）是一种无毒的具两亲性的低聚物，在生物医学领域得到了广泛的应用。经PEG修饰后蛋白质类药可降低免疫原性、延长半衰期［12］。CSPEG在生物医学和制药学上有潜在的意义，Fangkangwanwong等［13］将壳聚糖和羟基苯并三唑（HOBt）混合后溶解在水中，用碳二亚胺作为偶联剂在温和条件下使PEG接枝到壳聚糖上；杨心督等［14］用甲醛作为连接桥将聚乙二醇单甲醚连接在壳聚糖上，制得的mPEG－g－CS能够自组装成纳米微球，而且合成过程中的有机溶剂易于除去，反应周期相对较短。

作者参照文献［11］制备了CMCS并与PEG以不同的质量比混合后溶解在特定pH值的溶液中，通过氢键相互作用自组装形成CMCS／PEG纳米粒子，采用粒径分析仪研究其粒径大小与二者配比和溶液pH值之间的关系。

1 实验

1.1 试剂与仪器

壳聚糖（脱乙酰度91%，Mn＝20 000），青岛海汇生物工程有限公司；聚乙二醇（Mn＝4 000），国药集团化学试剂有限公司；盐酸（质量分数36%）、二甲基亚砜（DMSO）、十六烷基三甲基溴化铵、氯乙酸等均为分析纯。

C－MAG HS7型集热式磁力搅拌器；pHS－3C型pH计，上海雷磁；TENSOR－27型傅立叶红外光谱仪（KBr压片）；XRD－7000S／L型X－射线衍射仪；Malvern（Nano－ZS90）型粒径分析仪，英国马尔文仪器有限公司。

1.2 CMCS的制备

称取5g CS于500mL三口烧瓶中，加入40mL去离子水，置于30℃恒温水浴中溶胀30min。称取1.7665g NaOH于烧杯中，加入60mL去离子水配成NaOH溶液，将NaOH溶液用滴管滴加到烧瓶中碱化2h，调节水浴温度至60℃。将2.8625g氯乙酸溶解在25mL DMSO中，用注射器匀速将溶液滴入三口烧瓶中，重复此操作4次，加入相转移催化剂十六烷基三甲基溴化铵0.2533g，反应5h。待反应结束后用NaOH溶液调节pH值至中性，离心取上清液（下层为未反应的CS），加入无水乙醇，有凝胶状产物析出。

将析出的产物再溶解在水中，离心分离，取上清液，用旋转蒸发仪浓缩后倒入烧杯中加无水乙醇沉淀，得到凝胶状产物。将产物倒入离心管中，离心，弃掉液体，将固体产物收集到培养皿中，晾干后放入真空烘箱干燥，即得高取代度的CMCS。

1.3 自组装法制备CMCS／PEG纳米粒子

取0.2mL盐酸滴入100mL H2O中形成原始溶液，将其稀释配制成一系列不同pH值的溶液。将一定量的CMCS与PEG混合后溶解在10mL特定pH值的溶液中，用磁力搅拌器搅拌至充分溶解，使其通过氢键相互作用发生自组装，形成CMCS／PEG纳米粒子。PEG与CMCS的质量比及用量见表1。

2 结果与讨论

2.1 CS和CMCS的红外光谱（图1）

图1 CS和CMCS的红外光谱Fig.1 FTIR Spectra of CS and CMCS

由图1可看出，CS发生羧甲基化后在1 745cm－1附近出现新的吸收峰，这是脂肪酸羰基（C＝O）的特征峰，在1 628cm－1和1 414cm－1处出现了羧甲基钠盐的特征吸收峰，说明CS发生了羧甲基化反应。CMCS在1 597cm－1处出现－NH2的N－H变形振动峰，羧甲基化后的N－H变形振动峰和羰基的不对称伸缩振动吸收峰叠加变为单峰（1 628cm－1），强度增加，但位移很小，且1 560cm－1附近没有出现吸收峰，无酰胺基团中N－H的弯曲振动峰，可以认为CMCS中的－NH2几乎没有参与羧甲基化反应。且仲羟基的碳氧键的伸缩振动峰在1 100cm－1左右，反应前后变化不大，伯羟基的碳氧键的伸缩振动峰在1 070cm－1左右，羧甲基取代后此峰减弱，说明羧甲基取代主要发生在伯羟基上。

表1 PEG与CMCS的质量比及用量Tab.1 Mass ratio and dosage of PEG and CMCS

2.2 CS和CMCS的X－射线衍射分析（图2）

由文献可知，CS在2θ＝10°和2θ＝20°处有两个特征衍射峰。由图2可看出，当CS羧甲基化后，位于10°的衍射峰几乎都消失了，而20°的衍射峰的强度减弱。这是因为，在CS分子中的N、O位引入取代基后，削弱了CS分子内和分子间形成氢键的能力，破坏了CS分子链原有的规整性，导致其结晶性明显减弱。这也是CMCS能溶于水的主要原因［11］。

图2 CS和CMCS的XRD图谱Fig.2 XRD Patterns of CS and CMCS

2.3 CMCS／PEG纳米粒子的粒径分布及pH值响应性分析（图3、图4）

图3 不同条件下制备的CMCS／PEG纳米粒子的粒径分布Fig.3 Particle size distribution of CMCS／PEG nanoparticles prepared under different conditions

图4 CMCS／PEG纳米粒子在不同pH值下的粒径分布Fig.4 Particle size distribution of CMCS／PEG nanoparticles in different pH values

由图3可知，不同条件下制备的CMCS／PEG纳米粒子具有不同的粒径，其粒径分布的峰形较窄，说明粒径分布较为集中。当PEG∶CMCS＝4∶1、pH＝1.22时，所形成的粒子粒径最小为160nm左右，而当PEG∶CMCS＝6∶1、pH＝6.05时粒子粒径最大约为640nm。

由图4可知，CMCS与PEG以不同比例制备的粒子粒径均随溶液pH值的增大先增大后减小，且有一个粒径最大值。当pH＜5时，在同一pH值溶液中，随着PEG比例的增加，粒子的粒径先减小后增大；当pH≥5时，在同一pH值溶液中，随着PEG比例的增加，粒子粒径增大。这是因为，pH＜5时，CMCS中－COOH间的缔合较为严重，分子链呈卷曲状态，PEG以外壳的形式包覆在CMCS聚集体上，PEG向聚集体内部扩散形成紧实的粒子，此时粒子粒径较小；pH≥5时，－COOH间的缔合能力较弱，CMCS的分子链舒展与PEG以长链形式进行复合，形成的粒子粒径增大。当PEG的比例增加时，CMCS与PEG之间由于氢键作用相互吸引，且PEG与PEG之间也有氢键作用，相互聚集或交联形成网络结构使体积变大，粒子粒径也随之增大。综上所述，CMCS／PEG纳米粒子的粒径具有随pH值变化的特性，且PEG与CMCS的比例对粒径也有影响，粒子粒径随PEG比例的变化而变化。

2.4 CMCS／PEG纳米粒子的形貌分析（图5）

图5 CMCS／PEG纳米粒子的扫描电镜照片Fig.5 SEM Images of CMCS／PEG nanoparticles

由图5可知，CMCS／PEG纳米粒子由于氢键作用相互团聚，表面呈球形，单个粒子的粒径在20～50nm左右。

3 结论

将PEG和CMCS以不同的质量比溶解在系列pH值的溶液中，在氢键作用下发生自组装形成CMCS／PEG纳米粒子，方法简单、易于操作。不同配比下的粒子粒径均随pH值的增大先增大后减小；当pH＜5时，在同一pH值溶液中，随着PEG比例的增加，粒子粒径先减小后增大；当pH≥5时，在同一pH值溶液中，粒径随PEG比例的增加而增大。当PEG∶CMCS＝4∶1、pH＝1.22时，所形成的粒子粒径最小为160nm左右，而当PEG∶CMCS＝6∶1、pH＝6.05时粒子粒径最大约为640nm。CMCS／PEG纳米粒子粒径大小具有随溶液pH值变化的特性即具有pH值响应性。

［1］ NAIR L S，STARNES T，KO J W，et al.Development of injectable thermogelling chitosan－inorganic phosphate solutions for biomedical applications［J］.Biomacromolecules，2007，8（12）：3779－3785.

［2］ GONG J M，ZHOU Z T，HU L X，et al.Self－assembled chitosan nanotemplates for biomineralization of controlled calcite nanoarchitectures［J］.Applied Materials ＆Interfaces，2009，1（1）：26－29.

［3］ CURCIO M，PUOCI F，IEMMA F，et al.Covalent insertion of antioxidant molecules on chitosan by a free radical grafting procedure［J］.Agricultural and Food Chemistry，2009，57（13）：5933－5938.

［4］ WANG L N，LIU F，JIANG Y F，et al.Synergistic antimicrobial activities of natural essential oils with chitosan films［J］.Agricultural and Food Chemistry，2011，59（53）：12411－12419.

［5］ LEE D S，JE J Y.Gallic acid－grafted－chitosan inhibits foodborne pathogens by a membrane damage mechanism［J］.Agricultural and Food Chemistry，2013，61（26）：6574－6579.

［6］ AYOUB A，VENDITTI R A，PAWLAK J J，et al.Novel hemicellulose－chitosan biosorbent for water desalination and heavy metal removal［J］.ACS Sustainable Chemistry ＆Engineering，2013，1（9）：1102－1109.

［7］ SHI B Y，SHEN Z Y，ZHANG H，et al.ExploringN－imidazolyl－O－carboxymethyl chitosan for high performance gene delivery［J］.Biomacromolecules，2012，13（1）：146－153.

［8］ LUO Y C，TENG Z，WANG Q.Development of zein nanoparticles coated with carboxymethyl chitosan for encapsulation and controlled release of vitamin D3［J］.Agricultural and Food Chemistry，2012，60（3）：836－843.

［9］ WANG J，CHEN J S，ZONG J Y，et al.Calcium carbonate／carboxymethyl chitosan hybrid microspheres and nanospheres for drug delivery［J］.J Phys Chem C，2010，114（44）：18940－18945.

［10］ LIU X F，ZHI X N，LIU Y F，et al.Effect of chitosan，O－carboxymethyl chitosan，andN－［（2－hydroxy－3－N，N－dimethylhexadecyl ammonium）propyl］chitosan chloride on overweight and insulin resistance in a murine diet－induced obesity［J］.Agricultural and Food Chemistry，2012，60（13）：3471－3476.

［11］ 吴友吉，宋庆平，李庆海.高取代度羧甲基壳聚糖的制备［J］.合成化学，2006，14（5）：506－509.

［12］ 吴洁，刘景晶，胡卓逸.蛋白质药物的聚乙二醇修饰［J］.药学进展，2002，26（3）：146－151.

［13］ FANGKANGWANWONG J，AKASHI M，KIDA T，et al.Onepot synthesis in aqueous system for water－soluble chitosan－graftpoly（ethylene glycol）methyl ether［J］.Biopolymer，2006，82（6）：580－586.

［14］ 杨心督，陈汉，张惠珠，等.聚乙二醇单甲醚接枝壳聚糖自组装纳米球的制备［J］.中国新药杂志，2007，16（21）：1780－1783.

Preparation of CMCS／PEG Nanoparticle by Self－Assembly Method and Study on Its pH－Responsive Properties

CHEN Huai－jun，HE Ji－dong，DONG Hui－hui
（Key Laboratory of Rubber－Plastics of Ministry of Education，Shandong Provincial Key Laboratory of Rubber－Plastics，Qingdao University of Science ＆Technology，Qingdao 266042，China）

The carboxymethyl chitosan（CMCS）was prepared by chitosan（CS）and chloroacetic acid，then polyethylene glycol（PEG）and CMCS with different mass ratios were dissolved in solution of different pH values，CMCS／PEG nanoparticles were formed by self－assembly method under the hydrogen bond interactions.The relationship between particle size and mass ratio or pH value of the solution were studied.The results showed that，with the increase of pH value，particle size under different mass ratios increased first and then decreased；when pH＜5，with the content of PEG increased，the particle size decreased first and then increased in the same solution；when pH＝1.22，PEG∶CMCS＝4∶1，the minimum particle size was about 160nm；when pH≥5，with the content of PEG increased，the particle size increased in the same solution.These nanoparticles formed by self－assembly method have pH－responsive properties.

chitosan；carboxymethyl chitosan；polyethylene glycol；self－assembly；pH－responsive；CMCS／PEGnanoparticle

O 636.1

A

1672－5425（2015）01－0050－04

2014－09－26

陈怀俊（1990－），男，甘肃民乐人，硕士研究生，研究方向：功能与特种高分子材料；通讯作者：贺继东，教授，E－mail：hejidong＠chemist.com。

10.3969／j.issn.1672－5425.2015.01.012