液相色谱质谱方法对前列腺癌患者治疗前后血清中代谢组学的研究①

辛 华，江清林，王 莉，马 雷，王 琳，于海东，刘丽秋，刘君星，牟洪香

(1.佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

液相色谱质谱方法对前列腺癌患者治疗前后血清中代谢组学的研究①

辛 华1，江清林2，王 莉1，马 雷1，王 琳1，于海东1，刘丽秋1，刘君星2，牟洪香1

(1.佳木斯大学附属第一医院检验科，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：观察前列腺癌患者治疗过程中代谢物的变化，找寻其与前列腺癌患者治疗的关系，从而为前列腺癌的早期诊断和发病机制研究提供一个新的思路。方法：超高效液相色谱单级四级杆飞行时间串联质谱联用仪分别对临床四组受试者血清标本进行分析。结果：与正常组比较，前列腺癌未治疗组标志物分布有显著性差异(P<0.05)；前列腺癌治疗好组标志物分布有显著性差异(P<0.05)；前列腺癌治疗差组标志物分布有显著性差异(P<0.05)，两治疗组间标志物分布分布有显著性差异(P<0.05)。结论：研究发现共同参与了胆固醇代谢的三个有意义的代谢产物(脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸和二十二碳五烯酸)，它们可能在去势抵抗型前列腺癌转变中发挥重要作用。

前列腺癌；生物标志物；代谢组学

前列腺癌(prostate cance, PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一[1]。因Pca临床表现隐匿性和复杂性，早期诊断Pca比较困难，那么建立高效的检测方法尤为重要，尤其是筛查出血中循环蛋白质类生物标志物[2]。代谢组学是采用高通量化学分析技术，如质谱技术和核磁共振技术并结合化学计量方法对生物体系在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定量分析，从而定量描述生物体内源性代谢物整体代谢变化情况及其对内因和外因应答变化规律的一门新兴学科[3,4]。本研究基于液相色谱-质谱联用的代谢组学方法分析前列腺癌患者血清中内源性代谢物的变化，寻找与前列腺癌相关诊断标志物。在此基础上观察前列腺癌患者治疗过程中代谢物的变化，找寻其与前列腺癌患者治疗的关系，从而为前列腺癌的早期诊断和发病机制研究提供一个新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013～2014年佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市中心医院住院病人36例。其中PCa组12例,年龄52～74岁,平均61岁, 全部经前列腺穿刺病理诊断确诊为晚期患者。前列腺癌未治疗组(A)12例,年龄57～79岁，平均66岁；前列腺癌治疗好组(B)12例, 年龄59～81岁,平均69岁;前列腺癌治疗差组(C)12例, 年龄60～82岁,平均70岁;正常对照组(D)选取健康成年男性12例,年龄54～79岁,平均64岁。经肠指检及前列腺B超检查正常,排除泌尿系统疾病者。上述受试者年龄、体重均值差异无统计学意义(P>0.05)[5]。

1.2 主要仪器和试剂

超高效液相色谱单级四级杆飞行时间串联质谱联用仪及相关配套设备购自美国Waters公司，实验试剂甲醇，乙腈，甲酸为色谱纯级，购自Merck公司；氯苯丙氨酸，购自美国Sigma公司。

1.3 方法

临床受试者晨起空腹采血，在安静状态下，用5mL注射器抽取静脉血4mL，注入10mL离心管中，室温静置30min后，3000rpm离心5min。吸取上清液0.3mL放入冻存管中并做好标记，迅速放入液氮中冻存，后转入-80℃冰箱中保存待用。上样分析前使血清在室温解冻，然后严格按照超高效液相色谱单级四级杆飞行时间串联质谱联用仪的要求对样品衍生处理，以供分析。

1.4 统计学处理

采用软件MassLynxV4.1软件包提取数据，软件SIMCA-P software12.0进行PCA分析，结合判别分析及多元统计方法从海量数据中挑选出显著的代谢标志物。采用Hotelling’S T2检验差异性，定义P<0.05为显著性界值。

2 结果

2.1 临床受试四组血清中内源性代谢物质的水平

经与数据库对比前列腺癌组与正常对照组间有差异的可能生物代谢物有L色氨酸、十八酸、尿酸、磷脂醯乙醇胺、a-羟基异戊酸、20-羟基前列腺素F2a、12S-羟二十烷四烯酸、共轭亚油酸、硫酸脱氢表雄酮。前列腺治疗好组与治疗差组间有差异的可能生物标志物为脱氧胆酸、花生四烯酸、乳糖酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘油磷脂酰胆碱、二十二碳五烯酸、吡啶 、D-半乳糖-1-磷酸、三磷酸脱氧胞苷、脱氧胸苷、齐多夫定磷酸、4a-过氧四氢生物蝶呤、2-羟基二十三烷酸、 前列腺素D2-d4。在上述代谢物中L色氨酸、脱氧胆酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、吡啶、齐多夫定磷酸、三磷酸脱氧胞苷、甘氨鹅脱氧胆酸的平均水平在肿瘤组与正常对照组间、治疗好组与治疗差组间的差异有显著性意义(P<0.05)，且与疗效有关见表1。

表1 临床受试四组血清中8种内源性代谢物质的水平±s)

※前列腺癌各组与正常对照组比较P<0.05；○前列腺癌治疗好组与差组比较P<0.05。

3 讨论

代谢组学方法筛查生物标志物用于对前列腺癌的早期诊断和疗效观察的作用越来越重要。通过代谢组学方法动态描述癌症发展过程中代谢物的变化特点，进一步找出可能的生物标志物[6～9]。本研究中，我们探讨了可能的代谢生物标志物，其水平在四组临床受试者血清中的差异有统计学意义。在这些生物标志物中， L色氨酸、脱氧胆酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、吡啶 、齐多夫定磷酸、三磷酸脱氧胞苷、甘氨鹅脱氧胆酸的平均水平在癌组和正常对照组间显著不同(P<0.05)，上述物质在血清中水平同治疗差组比较，治疗好组平均水平更接近于正常对照组，这说明治疗好组血清中代谢物的变化与回落接近于正常对照组。

就身体其他器官而言，前列腺腺体内胆固醇水平通常较高，并且已有文献报道高胆固醇水平与前列腺癌发生相关[10]。我们查阅资料，发现脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸及二十二碳五烯酸共同参与了胆固醇代谢。而我们的研究表明，癌组受试者血清中脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸的水平明显高于正常对照组。说明由胆固醇衍变来的脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸可能促进了前列腺癌的发生。同治疗差组相比，它们在治疗好组受试者血清中的水平更接近于正常对照组，说明前列腺癌患者通过治疗血清中的代谢物变化再向正常人群接近。因此，脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸可能用于前列腺癌疗效的观察。二十二碳五烯酸是人体必需脂肪酸。一方面可作为抗炎或促炎症消退物质的前体[11]。而其另一重要功能是胆固醇的运输和氧化，从而能降低血清胆固醇水平[12]。众所周知，高胆固醇血症可以减少肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成及肿瘤细胞增殖[13,14]。在本研究中，二十二碳五烯酸在癌症未治疗组、治疗差组与正常组间存在统计学差异，治疗好与差组比较存在明显的统计学差异，而与正常组比较无统计学意义，其值更接近正常组，由此可见，二十二碳五烯酸可能是癌症治疗的潜在靶标。

癌症在生长中新陈代谢旺盛，其中色氨酸是其生长过程中必不可少的物质，由表1可见治疗好组的水平更接近于正常对照组。另外花生四烯酸、吡啶 、齐多夫定磷酸和三磷酸脱氧胞苷是癌症代谢中产生的物质，尤其在治疗差组中的水平更高，因此对于监测疗效具有意义。今后需进一步扩大标本数，为前列腺癌的治疗以及疗效观察筛查更有意义的可能生物性标志物。

[1]Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2007,57(1):43-66

[2]Ganz PA.Survivorship:adult cancer survivors[J].Prim Care,2009,36(4):721-741

[3]Nicholson JK,Lindon JC,Holmes E.‘Metabonomics’:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J].Xenobiotica, 1999,29(7):1181-1189

[4]Raamussdonk LM,Teusink B,Broadhurst D,et al.A functional genomics strategy that uses metabolome data to reveal the phenotype of silent mutations[J].Nat Biotechnol,2011,19(4):45-50

[5]马雷,辛华,高英英,等.血清总PSA、游离PSA 检测在前列腺癌诊断中的临床应用[J].黑龙江医药科学，2007,30(2)：11-12

[6]Chan EC, Koh PK, Mal M,et al. Metabolic profiling ofhuman colorectal cancer using high-resolution magic angle spinning nuclear magneticresonance (HR-MAS NMR) spectroscopy and gas chromatography mass spectrometry (GC/MS) [J].J Proteome Res ,2009,8(13): 352-361

[7]Denkert C, Budczies J, Kind T,et al. Massspectrometry-based metabolic profiling reveals different metabolite patterns ininvasive ovarian carcinomas and ovarian borderline tumors[J].Cancer Res,2006,66(78): 10795-10804

[8]Denkert C, Budczies J, Weichert W,et al. Metabolite profiling of human colon carcinoma deregulation of TCA cycle andamino acid turnover [J].Mol Cancer,2008,7(6):72

[9]Issaq HJ, Nativ O, Waybright T,et al. Detection of bladder cancer in human urine by metabolomic profiling using high performance liquidchromatography/mass spectrometry [J].J Urol ,2008,179(81):2422-2426

[10]Schaffner CP. Prostatic cholesterol metabolism: regulation and alteration [J].ProgClin Biol Res, 1981,75A: 279-324

[11]Bindi D, Marcus O, Julie M N, et al. Biogenic Synthesis, Purification, and Chemical Characterization of Anti-inflammatory Resolvins Derived from Docosapentaenoic Acid (DPAn-6) [J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(22):14744-14759

[12]Kaur G, Cameron-Smith D, Garg M, et al. Docosapentaenoic acid (22:5n-3): a review of its biological effects[J]. Prog Lipid Res, 2011,50(1):28-34

[13]Solomon KR, Pelton K, Boucher K, et al. Ezetimibe is an inhibitor of tumor angiogenesis [J].Am J Pathol ,2009,174(3):1017-1026

[14]Zhuang L, Kim J, Adam RM, et al. Cholesterol targeting alters lipid raft composition and cell survival in prostate cancer cells and xenografts[J].J Clin Invest,2005,115(4):959-968

黑龙江省卫生厅科研课题，编号：2011-398。

辛华(1970～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任技师,硕士研究生导师。

江清林(1964～)男，黑龙江林口人，硕士，研究员，硕士研究生导师。E-mail:hljyykx@163.com。

R737.25

A

1008-0104(2015)01-0074-02

2014-12-12)