人类软骨糖蛋白-39对成人膝关节软骨祖母细胞增殖的影响

陈跃平，董盼锋，章晓云，袁振中，饶毅

(1广西中医药大学附属瑞康医院，南宁530011；2广西中医药大学)

·论著·

人类软骨糖蛋白-39对成人膝关节软骨祖母细胞增殖的影响

陈跃平1，董盼锋1，章晓云2，袁振中2，饶毅2

(1广西中医药大学附属瑞康医院，南宁530011；2广西中医药大学)

目的 观察人类软骨糖蛋白-39(HCgp-39)对成人膝关节软骨祖母细胞增殖的影响。方法 取正常及OA关节软骨标本，向分离培养所得的软骨祖母细胞中分别加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCgp-39。收集培养0、24、48、72 h的细胞，加入10 μL的MTS检测液，酶标仪检测各孔光的吸收值(OD值)，比较各组细胞对HCgp-39的敏感性。结果 OA组：48 h时加入25、50、100、500 ng/mL组的OD值分别为0.81±0.01、0.88±0.02、0.93±0.01、1.03±0.04；72 h分别为1.02±0.05、1.12±0.01、1.21±0.01、1.28±0.01；与未加入HCgp-39组比较均有统计学差异(P<0.05或<0.01)；正常软骨组：48 h时加入25、50、100、500 ng/mL组的OD值分别为0.67±0.01、0.63±0.01、0.61±0.01、0.58±0.01；72 h分别为1.18±0.02、1.1±0、1.08±0.01、0.97±0.02；与未加入HCgp-39比较均有统计学差异(P<0.05或<0.01)。结论 在成人的关节软骨中存在软骨祖母细胞；HCgp-39能够促进关节软骨中软骨祖母细胞的增殖。

骨关节炎；软骨祖母细胞；人类软骨糖蛋白-39；细胞增殖

骨关节炎(OA)是一种以病变累及关节软骨、并继发的骨质增生为特点的慢性退行性关节疾病。OA在60岁以上人群中的发病率高达49%，好发于膝关节[1]。以往认为，成人软骨中仅含有终末分化的软骨细胞，而缺乏具有多向分化潜能的干细胞，但近年研究表明，在软骨表层可能存在具有分化功能的细胞系[2]。人类软骨糖蛋白-39(HCgp-39)是关节软骨自身分泌的细胞因子，主要来源于关节软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞等，OA时患者血清和关节液中HCgp-39含量明显增加，因此推测，HCgp-39异常增高可能与软骨组织的病理变化有关，并在一定程度上参与了软骨组织的重建和细胞外基质的合成。2012年7月～2013年12月，我们观察了HCgp-39对成人膝关节软骨祖母细胞增殖的影响，探讨HCgp-39参与OA的机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 正常标本与OA关节软骨标本分别取自1例股骨髁骨折行手术治疗的青年患者(男，34岁,右股骨髁粉碎性骨折，行切开复位内固定术)和1例因OA行关节置换的老年患者(女，61岁，左膝骨关节炎，行左膝人工关节置换术)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集受试者股骨髁间窝非负重区的关节软骨标本，立即送实验室，严格按照无菌要求剔除软骨组织上的软组织及血瘀块，并将其剪切成大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的软骨块，置4%多聚甲醛中固定5 d，再置于15% EDTA溶液中脱钙4周。常规乙醇脱水，包埋，5 μm厚连续切片，行苏木精伊红染色与番红O染色。光镜下观察，每张切片选择3个不同视野，参照Mankin[3]软骨病理评分标准进行评分。

1.2.2 软骨祖母细胞的分离、培养与鉴定 将软骨组织剪碎成2 mm×2 mm的小块，加入0.125%的胰酶消化，将消化处理后的软骨组织块重新剪碎成1 mm×1 mm的小块，平铺于含有H-DMEM培养基的培养瓶中，倒置培养4 h后翻瓶继续培养。

1.2.3 软骨祖母细胞的表型鉴定及分离培养 将传至2代的细胞浓度调整为1×107/100 μL进行培养，并行CD166和CD105抗原流式检测，确定软骨祖母细胞(CD166+和CD105+的细胞)的百分率后，对其再次进行扩大培养，细胞传至第3代时，采用流式分选的方法分离提取能够表达CD105/CD166的细胞(软骨祖母细胞)并进行纯度检测。

1.2.4 HCgp-39处理软骨祖母细胞 向分离培养的软骨祖母细胞中分别加入0、25、50、100、500 ng/mL的HCpg-39，消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度至1×105个/mL，加入96孔板中，100 μL/孔；待细胞贴壁后，收集HCgp-39作用0、24、48、72 h的细胞检测，并加入比例为1∶10的MTS，孵育4 h后，采用酶标仪进行读板，读取MTS检测OD490数据。不同浓度不同时间点分别检测3次。

2 结果

2.1 原代细胞及传代后形态观察 分离培养正常原代软骨细胞贴壁后，细胞呈多角型，扁平状，胞质丰富，可见清晰、圆形的细胞核，部分区软骨细胞集落样生长；OA原代软骨细胞形态多不规则，似成纤维细胞，贴壁较正常软骨细胞晚，生长速度也明显较正常软骨细胞慢，且多为单层生长，结节样细胞群和集落样生长少见。正常软骨细胞传代培养后细胞仍似椭圆形,细胞胞质丰富，随传代次数不断增加,细胞集落中的梭形细胞数目逐渐增多；OA软骨细胞传代培养后大部分会恢复到原来的梭形或短梭形，细胞突起会逐渐变长并向多角形演化，最终形成多角形，融合时间明显延长。

2.2 软骨祖母细胞的流式分选及纯度检测 在正常关节来源的软骨细胞中和OA关节来源的软骨细胞中均能分离出能够表达CD105及CD166的细胞(软骨祖母细胞)分别为2.29%和2.68%。对从正常关节和OA关节来源的软骨祖母细胞进行传代培养，并对最终培养所得的OA软骨祖细胞和正常软骨祖母细胞分选后细胞纯度检测分别为96.96%和92.97%。

2.3 不同浓度HCgp-39对两组软骨祖母细胞增殖的影响 见表1、表2。

2.4 不同浓度HCgp-39作用于两组软骨祖母细胞后祖母细胞增殖率的变化趋势 见图1、图2。

3 讨论

Chen等[4]利用电子扫描显微镜对从软骨和骨髓中分离得到的直径<5 mm的小细胞的超微结构进行分析，发现来自软骨的小细胞与来自骨髓的小细胞一样，均具有分化成软骨细胞的潜能。Barbero等[5]对人关节软骨中提取的细胞进行培养，对成软骨、成骨和成脂细胞进行诱导分化，结果显示，人关节软骨细胞中，有一部分细胞能够被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和骨细胞，且其分化能力的大小受细胞中转化生长因子β1及成纤维细胞生长因子2的影响。这些研究进一步说明，软骨中可能具有多向分化潜能的软骨祖母细胞存在。国际细胞治疗学会对干细胞的界定包括3点：在标准的培养条件下有黏附可塑性；表达CD105、CD90和CD73；缺乏CD34、CD45、CD14、CD79α、CD11b或CD19及HLA-DR表面分子的表达。Alsalameh等[6]采用免疫磁珠分离的方法也证实，无论是人的正常软骨组织还是发生OA的软骨中，均存在表达CD105/CD166的细胞(软骨祖母细胞)，且此类细胞经诱导培养后能够被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞及成脂肪细胞，而且在发生OA的软骨中表达CD105/CD166的细胞要明显多于正常软骨组织中的细胞。以上研究均说明，在关节软骨中存在具有多向分化潜能的干细胞。HCgp-39是壳质酶家族成员，相对分子量约为39 000，由分布于8 kb区域上的10个外显子构成。HCgp-39主要来源于关节软骨细胞、滑膜细胞、单核巨噬细胞和中性粒细胞，但其并不具备壳质酶活性[7]。目前认为，其可能与组织重建和细胞外基质的合成有关。HCgp-39在炎症性关节疾病患者血液和关节滑液中的表达高于正常关节，且在成人骨与关节重塑过程中能够阶段性和特异性表达[8]。Johansen等[9]对476例健康儿童、260例健康成人和63例创伤患者、54例OA患者进行测定，发现70岁以上人群和重度膝OA患者血清和关节液中HCgp-39水平明显增高，推测HCgp-39的增高可能与软骨的病理变化有关，可在一定程度反映炎症反应的程度和关节软骨降解破坏的程度，是关节破坏的一个诊断性标记物。在细胞培养中也发现HCgp-39对豚鼠软骨细胞和兔软骨细胞具有促有丝分裂作用，且具有剂量依赖性[10]，说明HCgp-39在组织重塑过程中具有一定作用。

表1 不同浓度 HCgp-39对OA软骨祖母细胞增殖 的影响

表2 不同浓度 HCgp-39对正常软骨祖母细胞增殖 的影响

图1 不同浓度HCgp-39对OA软骨祖母细胞 增殖率的影响

图2 不同浓度HCgp-39对正常软骨祖母细胞 增殖率的影响

本研究显示，向OA组关节软骨祖母细胞中加入HCgp-39后，检测各孔的OD值，结果第2天及第3天各剂量组与未加入HCgp-39相比均有统计学差异；OA软骨祖母细胞的增殖率随药物浓度的增加及作用时间的延长而呈增大趋势。有研究表明，HCgp-39主要在OA软骨的表层和中层表达，而在正常人的软骨中并不表达[11]。也有研究证实，OA患者血清HCgp-39水平与IL-6和CRP水平呈正相关，且随着病程延长及患者活动功能受限，血清HCgp-39浓度也会相应增加。在正常软骨组织中，软骨细胞的基质中各种成分的新陈代谢是一种缓慢的过程，软骨细胞基质分解与合成处于动态的平衡状态，但当这种内环境的平衡状态被打破，软骨细胞就会产生大量HCgp-39。有学者[12]研究了软骨细胞中HCgp-39的分泌规律，结果发现，即使在分离的正常软骨细胞培养的早期，作为对细胞外环境的反应，HCgp-39的分泌也会明显升高。因此推测，当由于不同原因导致关节软骨受损，诱发OA或者软骨周围的环境发生改变时，可能会激活软骨组织重建修复过程，在重建修复过程中刺激HCgp-39的分泌增多。在向正常软骨组的关节软骨祖母细胞中加入HCgp-39后，经过72 h培养，检测各孔光的OD值。结果第2天及第3天各剂量组与未加入HCgp-39相比均有统计学差异；正常软骨祖母细胞的增殖率随药物浓度的增加及作用时间的延长而呈减小的趋势。说明HCgp-39作用于正常软骨祖母细胞后，在一定时间内能够促进祖母细胞的增殖，而升高到一定程度时又表现为增殖受抑制的效应。Knorr等[13]发现，正常关节软骨内存在一定水平的HCgp-39，但其在正常软骨中的作用并不清楚。我们推测，HCgp-39在正常软骨组织中可能具有与TGF-β相似的作用，即在一定程度上能够抑制软骨细胞的增生肥大和钙化，使得软骨中始终保持一定数量具有潜在分化功能的母细胞，而当这种细胞的数量达到一定程度时，便会产生负反馈效应，使得HCgp-39的促软骨祖母细胞分裂增殖的作用减弱，与开始加入HCgp-39时相比，软骨祖母细胞的增殖率明显下降。

OA的发生发展是一个长期、慢性和逐步渐进的过程，涉及全身和局部的许多因素。其始动环节是关节软骨的退变，包括软骨细胞增殖与凋亡、合成能力的改变、降解增快、骨赘形成及细胞表型改变等。HCgp-39作为软骨自身分泌的细胞因子，无论对来自于OA患者软骨中的软骨祖母细胞还是来自于正常软骨中的软骨祖母细胞，均在一定时间内具有促进其增殖的作用。然而，这两种来源的细胞对HCgp-39的反应又有所不同，其具体的影响因素及机理仍需进一步研究。

[1] Lawrence RC, Felson DT, Helmick CG, et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States[J]. Part II.Arthritis Rheum, 2008,58(1):26-35.

[2] Hattori S, Oxford C, Reddi AH. Identification of superficial zone articular chondrocyte stem/progenitor cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007,358(1):99-103.

[3] 方锐,艾力江·阿斯拉,卢勇,等.兔骨性关节炎模型构建及早中晚期的特点[J].中国组织工程与临床康复,2010,14(7):1218-1222.

[4] Chen MH, Lin S, Hsieh CH, et al. Identification and initial characterization of small cells in adult cartilage and bone marrow[J]. J Formos Med Assoc, 2004,103(4):264-273.

[5] Barbero A, Ploegert S, Heberer M, et al. Plasticity of clonal populations of dedifferentiated adult human articular chondrocytes[J]. Arthritis Rheum, 2003,48(5):1315-1325.

[6] Alsalameh S, Amin R, Gemba T, et al. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage[J]. Arthritis Rheum, 2004,50(5):1522-1532.

[7] Volck B, Price PA, Johansen JS, et al. YKL-40,a mammalian member of the chitinase family,is a matrix protein of specific granules in human neutrophils[J]. Proc Assoc Am Physicians, 1998,110(4):351-360.

[8] Vos K, Steenbakkers P, Miltenburg AM, et al. Raised human cartilage glycoprotein-39 plasma levels in patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions[J]. Ann Rheum Dis, 2000,59(7):544-548.

[9] Johansen JS, Hvolris J, Hansen M, et al. Serum YKL-40 levels in healthy children and adults.Comparison with serum and synovial fluid levels of YKL-40 in patients with osteoarthritis or trauma of the knee joint[J]. Br J Rheum, 1996,35(6):553-559.

[10] De Ceuninck F, Gaufillier S, Bonnaud A, et al. YKL-40(cartilage gp-39)induces proliferative events in cultured chondrocytes and synoviocytes and increases glycosaminoglycan synthesis in chondrocytes[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001,285(4):926-931.

[11] Volck B, Ostergaard K, Johansen JS, et al. The distribution of YKL-40 in osteoarthritic and normal human articular cartilage[J]. Scand J Rheumatol, 1999,28:171-179.

[12] 苏晓恩,魏波,邓超桦.YKL-40在骨关节炎软骨细胞中的表达及意义[J].湖北医学,2011,17(9):1140-1142.

[13] Knorr T, Obermayr F, Bartnik E, et al. YKL-39 (chitinase 3-like protein 2),but not YKL-40 (chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic chondrocytes[J]. Ann Rheum Dis, 2003,62(10):995-998.

Effect of human cartilage glycoprotein-39 on proliferation of precartilaginous stem cells of adult articulear cartilage

CHENYue-ping1,DONGPan-feng,ZHANGXiao-yun,YUANZhen-zhong,RAOYi

(1RuikangHospitalAffiatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China)

Objective To investigate the effect of HCgp-39 on adult articular cartilage precartilagincus stem cells proliferation. Methods HCgp-39(0, 25, 50, 100, 500 ng/mL) were added into precartilaginous stem cells. After 0, 24, 48, 72 h, stem cells were collected, and subjected to 10 μL MTS, and then detecting OD490, comparing the cell sensibility to HCgp-39 in all groups. Results OA group: After 24 hours, the mean and standard deviation of cells subjected to 25, 50, 100, 500 ng/mL HCgp-39 were 0.81±0.01, 0.88±0.02, 0.93±0.01, 1.03±0.04, separately; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.02±0.05, 1.12±0.01, 1.21±0.01, 1.28±0.01, separately. When Compared with stem cells without subjecting to HCgp-39, there was no statistically differences; normal group: after 24 hours, the mean and standard deviation were 0.67±0.01, 0.63±0.01, 0.61±0.01, 0.58±0.01; after 72 hours, the mean and standard deviation were 1.18±0.02, 1.1±0, 1.08±0.01, 0.97±0.02; comparing with cells without subjecting to HCgp-39, the differences were statistically significant. Conclusions There are articular cartilage cell proliferation in the adult articular cartilage; HCgp-39 had the promotional effects on proliferation of precartilaginous stem cells.

osteoarthritis; precartilaginous stem cells; human cartilage glycoprotein-39; proliferation of cells

广西医疗卫生重点科研课题(重2010097)。

陈跃平(1970-)，男，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为股骨头缺血坏死的诊治。E-mail: chenyueping007@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.01.001

R684.3

A

1002-266X(2015)01-0001-04

2014-08-22)