永城煤矿塌陷区水塘污染状况及鲫鱼血液对其的指示研究

杨军英，刘慧兵，闫永峰

(1．河南师范大学体育学院，河南新乡 453007;2.河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007;3.商丘师范学院生命科学学院，河南商丘 476000)

永城煤矿塌陷区水塘污染状况及鲫鱼血液对其的指示研究

杨军英1，刘慧兵2，闫永峰3*

(1．河南师范大学体育学院，河南新乡 453007;2.河南师范大学省部共建细胞分化调控重点实验室，河南新乡 453007;3.商丘师范学院生命科学学院，河南商丘 476000)

为了评估永城煤矿塌陷区重金属污染情况，用水生生物指示水污染程度，采用pH计和原子吸收光谱法结合石墨消解法，检测永城煤矿塌陷区土壤和水体样本的pH值和重金属含量,以污染区的鲫鱼(实验组)和天沐湖自然保护区的鲫鱼(对照组)作为样本，观察胁迫条件下鲫鱼血常规和形态的变化.结果表明，煤矿塌陷区土壤和水体都呈弱酸性，符合土壤和地表水环境质量标准.塌陷区土壤和水体中五种重金属Cu,Cd,Pb,Cr和 Zn浓度均显著高于对照组(P<0.05).实验组鲫鱼白细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞百分率明显高于对照组(P<0.01)，而红细胞数、血红蛋白含量、中性粒细胞和嗜碱性细胞百分率均明显减少(P<0.01).实验结果提示，该塌陷区域水体和土壤均有不同程度的重金属污染.鲫鱼的血细胞数目和形态均发生了显著变化.

永城；煤矿塌陷区；重金属；鲫鱼；血细胞

伴随着煤矿工业的发展和资源的过度开采导致的大面积土地塌陷，已成为目前煤矿工业最严重的地质灾害，环境问题和社会问题尤为严峻和突出.而塌陷区地势低洼，雨水和地下水蓄积形成了常年的积水区，周围的陆地生态环境变成了水生生态环境和湿地环境[1].由于毒性的持久性和生物蓄积性，重金属污染成为煤矿塌陷区的另一严重危害[2]，进一步造成了土壤、水体甚至动植物体污染[3].因此，塌陷区的水土和生物监测是有效评价矿区环境质量和环境治理规划必不可少的工作.鱼的生理生化活动易受环境因素的影响，尤其是对重金属特别敏感，常常被作为重金属污染的敏感生物指示物(Sensitive bio-indicator)用以评价水生生态系统的健康状况[4].有研究表明，在Cu2+，Cr6+污染条件下，鲫鱼白细胞、红细胞等显著增多，以对抗可能由Cu2+污染引起的感染[5,6]. 永城市地处豫东平原，是我国重要的无烟煤基地.永城全市耕地约占总面积的70%.截至2005年底，永城市矿区塌陷面积已达2.67×107m2，覆盖5个乡镇，87个村庄，塌陷区一半以上形成积水.近些年，虽然相关部门针对重金属污染对该区域进行了治理，但水土资源能否被利用还需要进行评估.本研究对该地区的水体和土壤的pH和重金属含量以及鲫鱼血液进行检测，为永城市煤矿塌陷区的污染监测和治理提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

火焰原子吸收光谱仪，CWH-20 石墨消解仪，雷磁 PHS-3BW 高精度台式酸度计，聚四氟乙烯消解罐，浓硝酸、高氯酸、氢氟酸、浓盐酸、硝酸镧等试剂均为分析纯.

1.2 实验样地

研究样地为河南省永城市十八里镇刘岗村(33°57′N，116°21′E),此塌陷区形成于2006年，面积近30 hm2.

对照样地为天沐湖自然保护区(34°35′N，115°41′E),属于商丘市黄河故道的一部分.大面积的湿地、草滩构成了典型的河谷自然景观,附近没有厂矿企业和其他污染源.

1.3 样品采集与预处理

土壤样本 在研究样地的自然水塘和对照样地的湖水附近随机采集 20 cm 左右深度的湿土各 5 份，自然风干后，研磨，过0.149 mm尼龙筛，混匀分装后待检.

水样和生物样本 在研究样地的水塘和对照样地的湖水中随机采集水样各 5 份.同时，选择同一种且大小和质量相似的鲫鱼各10条，实验组样本体长(20.8±2.3) cm，体重(197.6±18.1) g.对照组样本体长(24.5±3.6) cm，体重(236.8±17.4) g.

1.4 pH检测

土壤pH检测 精确称取风干过滤的土样，按1∶2.5的水土比例加去除CO2的水，剧烈搅拌5 min，使土粒分散均匀，放置1～3 h.试样溶液摇匀后用pH计直接检测.每个样品重复测3次.

水样pH检测 用滤纸过滤后，用校准好的pH计直接检测.

1.5 重金属含量检测

土壤重金属含量检测 称取土壤样品0.5 g置于消解罐中(每个样品做2个平行对照)，参照文献[7]，用四酸消解法消解后，用少量1% HNO3溶液冲洗罐壁、溶解残渣，定容至25 mL.使用火焰原子吸收分光光度计测定消解液中的铜、镉、铅、铬、锌含量.

水样重金属含量检测 取0.45 μm 滤膜过滤的水样各100 mL，加浓硝酸进行消解，加蒸馏水定容至100 mL，测定其中铜、锌、铅、镉、铬的浓度.

1.6 鲫鱼血细胞计数和形态学观察

取鲫鱼用纱布将其身体擦干，以体侧穿刺尾动脉取血法采血[8]，取少量血液制作血涂片，晾干,甲醇固定15 min，用瑞氏-吉姆萨染液染色30 min.中性树胶封片，显微镜下观察计数.

1.7 数据分析

实验数据用SPASS做统计分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著.

2 结果

2.1 水样和土壤pH

永城煤矿塌陷区水样和土壤的pH均偏酸性(图1)，和对照组相比具有显著性差异(P<0.01)，但符合地表水环境质量标准(pH6-9)和土壤环境质量标准.水样pH略高于土壤pH，可能是由于矿物质中含硫无机盐溶解，改变了塌陷区鱼塘的pH.

图1 水样和土壤pHFig 1pH of the water and soil

*P<0.05,和对照组相比(Compared to control group)

2.2 水样重金属含量

地表水环境质量标准(GB3838-2002 Ⅲ)规定，重金属Cu,Cd,Pb,Cr和Zn的含量分别≤1.0,0.005,0.05,0.05和1.0 mg·L-1.对照组水样中重金属浓度均在 Ⅲ 类水标准所规定的范围内，塌陷区水样中重金属含量均显著高于对照组(P<0.05).除 Cu 略高于标准值外，其余重金属含量均远大于标准值(图2).表明塌陷区水域受到Cr,Cd,Pb的污染比较严重，可能会对其中的水生生物产生影响.

图2 水样中重金属的浓度Fig 2Concentration of heavy metals in the water

*P<0.05,和对照组相比(Compared to control group)

2.3 土壤重金属含量

土壤环境质量标准(GB15618-1995Ⅰ)规定，重金属Cu,Cd,Pb,Cr 和Zn的含量分别≤500,1.0,500,400和500 mg·kg-1.对照组土样中重金属浓度均在标准范围内(图3)，塌陷区土样中五种重金属浓度均高于Ⅰ类标准的约2倍，且显著高于对照组(P<0.01).表明塌陷区的土壤被重金属污染.

图3 土样中重金属的浓度Fig 3Concentration of heavy metals in the soil

*P<0.05,和对照组相比(Compared to control group)

2.4 鲫鱼血细胞数量和形态变化

与对照组相比，实验组的白细胞数、淋巴细胞百分率和嗜酸性粒细胞百分率显著增多(P<0.01)(图4)，而红细胞数、血红蛋白含量、单核细胞百分率、中性粒细胞百分率和嗜碱性细胞百分率都明显减少(P<0.01).可能与塌陷区水中含有大量重金属、鲫鱼正常生长受到了胁迫、激活了应激反应有关.

图4 鲫鱼血细胞数量变化Fig 4The numbers of blood cell of crucian

**P<0.01,和对照组相比(Compared to control group)

对照组鲫鱼各组之间差异很小，各类细胞分布均匀，可看到较大的单核细胞和数量最多的血细胞(图5).实验组红细胞数目减少，有核细胞数目增加，几乎没有发现单核细胞，这与血液计数检测的结果基本一致.

A,B分别为实验组、对照组(Represent the experimental group and control group,respectively)

图5 鲫鱼全血瑞氏-吉姆萨染色

Fig 5The G-W staining of whole blood

3 讨论

监测煤矿及塌陷区周围水土的重金属污染十分重要，特别是进行渔业养殖、用水等开发利用活动时必须对该区域环境做有效评价.本研究检测了永城煤矿塌陷区的土壤和水域中五种重金属含量，并参照地表水环境质量标准(GB 3838—2002)规定的 Ⅲ 类水和土壤环境质量标准(GB 15618—1995)规定的Ⅰ类标准，对其污染程度进行评价.研究结果发现，塌陷区水样和土壤均偏酸性，但尚在标准范围内.水样中Cr,Pb,Cd,Zn含量远远高于标准，土壤中重金属含量约是标准的约2倍,土壤和水均被不同程度污染.

鱼类对于水污染敏感且种群庞大，被生物界称为监测水质好坏的“活体机器”[9,10]，是毒性试验、环境监测等研究中常选用的实验材料.生物体的生理和病理的变化往往会引发血液成分的改变，所以对血液成分的检测具有十分重要的意义.血液是测定鱼类免疫功能变化的重要指标之一.结合全血生理指标检测和瑞氏-吉姆萨染色，我们发现塌陷区鲫鱼的红细胞和血红蛋白减少，白细胞数增加.此结果和文献报道基本一致[5,6],提示鲫鱼处于此胁迫状态下，其血细胞的形态和数目均发生了变化.

[1] GONG S L,LI C,YANG S L.The microscopic characteristics of Shanghai soft clay and its effect on soil body deformation and land subsidence[J].EnvironGeol,2009,56(6):1051-6.

[2] GUAN Y,SHAO C,JU M.Heavy metal contamination assessment and partition for industrial and mining gathering areas[J].IntJEnvironResPublicHealth,2014,11(7):7286-303.

[3] YAO D X,MENG J,ZHANG Z G.Heavy metal pollution and potential ecological risk in reclaimed soils in Huainan mining area[J].JCoalSciEng(China),2010,16(3):316-9.

[5] 凌善峰.污染因子Cu2+对鲫鱼血细胞的影响[J].聊城师范学院学报:自然科学版，2002,15(3):41-44.

[6] 南旭阳.铬离子对鲫鱼红细胞核、血细胞数和血红蛋白量影响的研究[J].浙江师范大学学报:自然科学版,2002,25(3):303-307.

[7] 杨晓婧，李美丽，白建华.火焰原子吸收光谱法测定废水中的重金属离子[J].光谱实验室，2010，27(1):247-9.

[8] 杨兴棋.鱼类的采血技术[J].淡水渔业,1979(Z1):43-44.

[9] BURGER J,TSIPOURA N.Metals in horseshoe crab eggs from Delaware Bay,USA:temporal patterns from 1993 to 2012[J].EnvironMonitAssess,2014,186(10):6947-58.

[10] QADIR A,MALIK R N.Heavy metals in eight edible fish species from two polluted tributaries(Aik and Palkhu) of the river Chenab,Pakistan[J].BiolTraceElemRes,2011,143(3):1524-40.

(责任编辑 俞诗源)

Pollution status and indicator effect ofCarassiusauratusblood in the water of Yongcheng coal mine subsidence area

YANG Jun-ying1，LIU Hui-bin2，YAN Yong-feng3

(1.College of Physical Education,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China; 2.Key Laboratory for Cell Differentiation Regulation,Henan Normal University,Xinxiang 453007,Henan,China; 3.School of Life Sciences,Shangqiu Normal College,Shangqiu 476000,Henan,China)

In order to evaluate the heavy metal pollution and indicate the pollution status usingCarassiusauratusblood in the water of Yongcheng coal mine subsidence area,pH and the content of heavy metal of soil and water samples have been detected by pen pH meter and atomic absorption spectrometry combined with Graphite digestion system.Carassiusauratussamples are collected from Yongcheng subsidence area(experimental group) and Tianmu lake nature reserve(control group) to observe the change of the blood routine examination and morphological when it is under stress condition.The results show that both soil and water pH are faintly acidic and within the soil environment degree of quality standard and surface water quality standard.The contents of Cu,Cd,Pb,Cr and Zn are higher than that of control both in water and soil samples(P<0.05).The numbers of white blood cell,lymphocyte and eosinophilic granulocyte percentage of experiment group are higher than that of control group(P<0.01).Nevertheless,the numbers of red blood cell and hemoglobin,neutrophile granulocyte and basicyte percentage are lower than that of control group(P<0.01).The result imply that the water and soil in Yongcheng coal mine subsidence area have been polluted by heavy metals at varying degree. The number and morphological of blood cell have been changed significantly under this stress condition.

Yongcheng;coal mine subsidence area；heavy metals；Carassiusauratus；blood

2005-03-10;修改稿收到日期:2015-04-20

河南省基础研究与前沿项目(122300410253，122300410033)

杨军英(1971—)，女，陕西宝鸡人，副教授，博士.主要研究方向为细胞分化. E-mail:041146@htu.cn

*通讯联系人，男，教授，博士.主要研究方向为动物生态学.E-mail:yanyf01@sina.com

S 131.2

A

1001-988Ⅹ(2015)04-0086-04