Germlin1与NT-proBNP在肝硬化进展过程中的表达①

贾 薇，胡立华，张沛怡

(1.佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江省医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150036)

Germlin1与NT-proBNP在肝硬化进展过程中的表达①

贾 薇1，胡立华2，张沛怡2

(1.佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154003;2.黑龙江省医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150036)

目的：研究Germlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表达以及两者在不同程度肝硬化中的表达与变化，分析两者在肝硬化进展过程中的作用。方法：分别采用免疫组织化学SP染色法检测Germlin1、免疫荧光定量法检测NT-proBNP在正常肝脏组织、慢性乙型肝炎以及乙型肝炎后肝硬化中的表达，以及两者在肝硬化不同Child-Pugh分级中的表达。结果： Gremlin1及NT-proBNP在正常肝脏组织中的表达率分别为16.7%、26.7%，在慢性乙型肝炎中的表达率分别为49.0%、40.8%，在乙型肝炎后肝硬化中的表达率分别为67.8%、59.3%，差异具有显著性(P<0.01)；Germlin1在肝硬化Child-PughA、B、C级中的表达率分别为38.5%、70.0%、84.0%，三者比较具有统计学意义(P<0.05)；NT-proBNP在肝硬化Child-PughA、B、C级中的表达率分别为38.5%、50.0%、76.9%，三者比较具有统计学意义(P<0.05)；Gremlin1及NT-proBNP之间也呈正相关。结论：Gremlin1及NT-proBNP在肝硬化中的表达显著增高，且Gremlin1是重要的促肝纤维化因子。Gremlin1及NT-proBNP对肝纤维化的诊断及预后判断具有潜在的应用价值。

Gremlin1;NT-proBNP;肝纤维化;免疫组化;免疫荧光定量法

Gremlin1属于BMP拮抗剂家族的成员。慢性肝损伤后的炎症修复过程激活转化生长因子-β1(TGF-β1)信号，TGF-βsmad信号通路活性受到骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMP)负向调节作用，而TGF-β信号转导通路对gremlin1的表达起到正向调控的作用。炎症时TGF-β信号异常增强，上调gremlin1基因表达，反馈性的抑制BMPs的功能，并由此进一步强化TGF-β信号转导通路，进而对纤维化的形成起到加速作用。新近的研究发现，Gremlin1与多种纤维化疾病及肿瘤有关[1，2]。

B型利钠肽又称为脑利钠肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利钠肽家族成员之一。具有拮抗肝硬化引起血流动力学及神经内分泌功能改变的作用。氨基端脑钠肽前体(NT-proBNP) 是一种前激素原BNP。最近的研究报道称NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表达，其表达程度与肝纤维化程度成正比[3，4]。因此本研究旨在通过检测Gremlin1及NT-proBNP在慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化中的表达以及两者在不同程度肝硬化中的表达与变化，探讨两者在肝硬化进展过程中的作用。

1 实验材料

1.1 标本来源及实验分组

收集黑龙江省医院消化内科2012-12～2014-03经临床和肝活检病理切片确诊为慢性乙型肝炎的患者49例、乙型肝炎后肝硬化的患者59例。其中59例乙型肝炎后肝硬化患者按ChildPugh分级法依次分成ChildPughA级13例,B级20例,C级26例。同时设正常对照组30例，均为无病毒性肝炎及肝硬化等肝脏疾病史，而因肝外伤而行肝脏切除术患者的肝组织或者由于仅有肝脏血清酶学改变而行肝穿刺后病理正常的肝脏组织。每例患者均在入院后第二天空腹抽取肘静脉血1.5mL，置于已经加入乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)溶液的试管中。全部病例必须排除心衰患者。

1.2 主要试剂

Gremlin1抗体、PBS缓冲液、乙二胺四乙酸钠 (EDTA-Na) 溶液、EDTA抗原修复液、通用SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。NT-proBNP试剂盒购自美国ADL公司。

2 实验方法

2.1Gremlin1检测

取肝活检组织标本置于10%甲醛中固定24h，石蜡包埋，制成5μm切片。采用免疫组化SP法检测Gremlin1的表达情况。对照：以肝癌组织作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。实验步骤严格按照操作说明，抗原修复用EDTA抗原修复液直接煮沸抗原修复。

2.2 血浆NT-proBNP浓度测定

早晨空腹抽取肘静脉血约1.5mL,置于已经加入乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na)溶液的试管中,在4h内送检。在TriageMeterPlus全自动测定仪上使用免疫荧光定量法测定。

2.3 结果判定

Gremlin1阳性细胞染色为胞浆出现棕黄色-黄色均匀颗粒。观察10个高倍视野计算阳性细胞数，以百分数表示( 阳性细胞数/总细胞数)。将阳性细胞百分数的结果分为四个等级，≥25%为(-)，25%～50%为(+)，50%～75%为()，> 75%为()。

NT-proBNP血浆浓度的参考范围在0～125pg/mL。

2.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，数据采用χ2检验，P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示有显著差异性。

3 结果

3.1Gremlin1在不同肝脏组织中的表达

Gremlin1表达的蛋白定位于阳性表达的细胞胞浆，呈棕黄色-黄色颗粒，在正常肝脏组织中的表达率为16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表达率为49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表达率为67.8%(40/59)。Gremlin1在三组病例中的表达具有显著差异性(χ2=20.828，P=0.000)，见表1、图1。

3.2NT-proBNP在不同肝脏组织中的表达

在无肝脏相关疾病患者血浆NT-proBNP水平平均值为(49.32±7.8)pg/mL、慢性乙型肝炎患者血浆NT-proBNP水平平均值为(85.3±15.23)pg/mL、乙型肝炎后肝硬化患者血浆NT-proBNP水平平均值为(254.48±695.43)pg/mL，表达率分别为26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比较具有统计学意义(χ2=9.264，P<0.05)，见表2。

表1 Gremlin1在不同肝脏组织中的表达及阳性率

图1 Gremlin1在正常肝脏组织(A)、慢性乙型肝炎(B)及乙型肝炎后肝硬化(C)中的表达(×400)

组别nPositive(%)χ2P对照组308(26．7)慢性乙型肝炎4920(40．8)9．264<0．05乙型肝炎后肝硬化5935(59．3)

3.3Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分级中的表达

Gremlin1在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分级中的表达率分别为Child-PughA38.5%(5/13)、Child-PughB70.0%(14/20)、Child-PughC84.0%(21/26)，三者比较具有统计学意义(χ2=7.173，P<0.05)；血浆NT-proBNP水平在不同ChildPugh分级间依次增高，其中Child-PughA级者NT-proBNP均值为(35.48±2.18)pg/mL、Child-PughB级者NT-proBNP均值为(159.32±10.50)pg/mL、Child-PughC级者NT-proBNP均值为(413.81±26.75)pg/mL，其表达率分别为38.5%(5/13)、50.0%(10/20)、76.9%(20/26)，三者比较具有统计学意义(χ2=,6.402，P<0.05)，见表3。

表3 Gremlin1及NT-proBNP在乙型肝炎后肝硬化不同Child-Pugh分级中的表达及阳性率

3.4 59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1与NT-proBNP表达的关系

59例乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1有40例表达阳性，其中28例NT-proBNP表达，占70%；另外24例NT-proBNP表达阴性的乙型肝炎后肝硬化中，12例Gremlin1表达，占50%。两者之间具有关联性(χ2=5.869，P<0.05)，并可见二者呈正相关，见表4。

表4 乙型肝炎后肝硬化中Gremlin1、NT-proBNP表达的相关性

4 讨论

肝纤维化是多种慢性肝病所共有的病理改变，是机体对各种病因引起的慢性肝损伤后的一种损伤修复反应[5],是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段[6]。各种常见的致病因子包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、遗传和代谢疾病、化学毒物或药物、肝脏淤血、脂肪肝、寄生虫病等[7]。在这些致病因素的作用下，静止期的肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC)被激活，同时增殖、转化为肌成纤维样母细胞(Myofibroblast，MF)，分泌大量细胞外基质(extracellarmatrix，ECM)。细胞外基质合成与降解失去动态平衡，导致细胞外基质在肝脏过度沉积而引起肝纤维化。

Gremlin1基因首先从爪蟾中枢神经脊中克隆出来，其编码的蛋白质有三种，分别是gremlin1、gremlin2和gremlin3。其中gremlin1是一种结构高度保守的分泌型蛋白，定位于染色体 15q13-q15[8，9]，属于BMP拮抗剂家族的成员。Gremlin1不仅存在于胚胎时期，也存在于成年动物个体。人体多种组织包括脑、卵巢、大肠以及病理过程中的肝脏、肺组织等都有Germlin1 的表达，Gremlin1 可能在器官、体征的形成和组织分化中起重要的作用[10]。有充分的依据表明，Gremlin1是糖尿病肾纤维化主要的促进因子[11]，在肺纤维化过程中也起着重要的促进作用[12]。新近的研究发现，Gremlin1与多种纤维化疾病及肿瘤有关[1，2]。研究表明Gremlin1 也与肝纤维化有关，是重要的肝纤维化促进因子。本研究结果显示Gremlin1在正常肝脏组织中的表达率为16.7%(5/30)，在慢性乙型肝炎中的表达率为49.0%(24/49)，在乙型肝炎后肝硬化中的表达率为67.8%(40/59)。在统计学上具有差异性(P<0.01)。Gremlin1的阳性表达率在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分级间呈依次增高。检测Gremlin1可能对慢性乙型肝炎向肝纤维化、肝硬化乃至肝癌演变过程的研究具有较高价值。

B型利钠肽又称为脑利钠肽(B-typenatriureticpeptide，Brainnatriureticpeptide，BNP)，是利钠肽家族成员之一。在心肺、骨髓、脑等组织中广泛分布，尤其在心脏中的含量最高。主要由心室肌细胞产生和分泌。肝硬化患者处于系统循环高动力状态，有潜在诱发心功能不全的可能。BNP具有扩张血管，降低血压，拮抗肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)，促进尿钠排泄、减少水钠潴留等作用, 从而减轻心脏负荷,纠正心力衰竭。国外已有文献报道肝硬化时血浆BNP水平增高[13]。氨基端脑钠肽前体(NT-proBNP) 是一种前激素原BNP。NT-pro-BNP较长的半衰期使其成为反映心室应激状态的一个更精确的指标,是使用最广泛的心衰生物标志物[14]。最近的研究报道称NT-proBNP在丙肝病毒感染患者中呈高表达，其表达程度与肝纤维化程度成正比[3，4]。本实验研究发现，NT-proBNP在正常对照组、慢性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化表达率分别为26.7%(8/30)、40.8%(20/49)、59.3%(35/59)，三者比较具有统计学意义(P<0.05)。且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分级间呈依次增高表达。表明了NT-proBNP可能参与了肝纤维化的进展。

Gremlin1与NT-proBNP可能共同促进肝纤维化的发展。心力衰竭发生发展的基本机制是心室重塑。肝硬化患者处于系统循环高动力状态，有潜在诱发心功能不全的可能。BNP具有拮抗肝硬化引起血流动力学及神经内分泌功能改变的作用。TGF-β1是重要的促纤维化因子，可诱导心肌纤维化，导致心室重塑，因此NT-proBNP可能是通过TGF-β信号转导通路与Gremlin1共同促进肝纤维化的发展。本实验结果显示，在59例乙型肝炎后肝硬化标本中，Gremlin1阳性表达40例，NT-proBNP阳性表达35例，共同阳性表达28例，共同阴性12例。二者在乙型肝炎后肝硬化中的表达具有正相关性，并且在乙型肝炎后肝硬化不同ChildPugh分级间均呈现递增趋势。提示两者在肝纤维化的发生、发展过程中可能起到协同作用， 两种因子的联合检测可能为临床诊治提供更为敏感的无创诊断标志，并且采取切实可行的抗肝纤维化治疗，进而达到治疗肝硬化、预防肝癌发生的可能。

[1]NamkoongH，ShinSM，KimHK，etal．Thebonemorphoge-neticproteinantagonistgremlin1isoverexpressedinhumancancersandinteractswithYWHAHprotein[J]．BMCCancer，2006，18(6):74

[2]SneddonJB，ZhenHH，MontgomeryK，etal．Bonemor-phogeneticproteinantagonistgremlin1iswidelyexpressedbycanc-er-associatedstromalcellsandcanpromotetumorcellproliferation[J]．ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(40):14842-14847

[3]MatsumoriA,ShimadaT,ChapmanNM,etal.MyocarditisandheartfailureassociatedwithhepatitisCvirusinfection[J].JCardFail，2006，12:293-298

[4]WangL,GengJ,LiJ,etal.ThebiomarkerN-terminalpro-brainnatriureticpeptideandliverdiseases[J].ClinInvestMed，2010，34(1):1-8

[5]FriedmanSL.Molecularregulationofhepaticfibro-sis,anintegratedcellularresponsetotissueinjury[J].JBiolChem，2000，275:2247-2250

[6]赵文丽,姜庆久,吴影.红花对实验性大鼠肝纤维化的抑制作用[J].黑龙江医药科学,2004,27(4):4-5

[7]陈廷玉,王景涛,张波.小柴胡汤抗肝纤维化的形态学和血清学实验研究[J].黑龙江医药科学,2003,26(4):48-49

[8]TopolLZ，MarxM，LaugierD，etal．Identificationofdrm，ano-velgenewhoseexpressionissuppressedintransformedcellsandwhichcaninhibitgrowthofnormalbutnottransformedcellsinculture[J]．MolCellBiol，1997，17(8):4801-4810

[9]NicoliS，GilardelliCN，PozzoliO，etal．Regulatedex-pressionpatternofgremlinduringzebrafishdevelopment[J]．GeneExprPatterns，2005，5(4):539-544

[10]MichosO，PanmanL，VinterstenK，etal．Gremlin-mediatedBMPantagonisminducestheepithelialmesenchymalfeedbacksignalingcontrollingmetanephrickidneyandlimborganogenesis[J]．Development，2004，131(14):3401-3410

[11]ZhangY，ZhangQ．Bonemorphogeneticprotein-7andGrem-lin:Newemergingtherapeutictargetsfordiabeticnephropathy[J]．BiochemBiophysResCommun，2009，383(1):1-3

[12]FarkasL，FarkasD，GauldieJ，etal．Transientoverexpres-sionofGremlinresultsinepithelialactivationandreversiblefibrosisinratlungs[J]．AmJRespirCellMolBiol，2011，44(6):870-878

[13]Kosf,LeeTY,ChengttNSH.LaiHmchengYfTdaiccCtfindingsatlupusmesentericVasculitis[J].ActaRadiol,1997,8(1):115-120

[14]EugeneBraunwald,MD.Biomarkersinheart[J].FailureNEnglJMed, 2008,358:2148

The expression of Germlin1 and NT-proBNP in the development of liver cirrhosis

JIAWei1,HULi-hua2,ZHANGPei-yi2

(1.The Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China;2.The Department of Gastroenterology, the Hospital of Heilongjiang Province, Harbin 150036, China)

Objective: To research the expressions of Germlin1 and NT-proBNP in chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis, and their expressions and changes in different degrees of liver cirrhosis; and to analysis their roles in the development of liver cirrhosis. Methods: Germlin1 was detected by using the method of immunohistochemical SP staining, and NT-proBNP’s expressions in normal liver tissue, chronic hepatitis B and hepatitis B cirrhosis together with their expressions in different Child-Pugh’s classification of liver cirrhosis were detected by using the method of the Immunofluorescence quantification. Results: The expression rates of Gremlin1 and NT-proBNP in normal liver tissue was 16.7%、26.7%, 49.0%、40.8% in chronic hepatitis B, 67.8%、59.3% in Hepatitis B cirrhosis. The difference was significant(P<0.01).TheexpressionratesofGremlin1inlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 70.0%, 84.0%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).TheexpressionratesofNT-proBNPinlivercirrhosisChild-PughA,B,C-levelwere38.5%, 50.0%, 76.9%,andtheywerestatisticallysignificantbycomparison(P<0.05).Gremlin1andNT-proBNPwerepositivecorrelation. Conclusion: The expressions of Gremlin1 and NT-proBNP in liver cirrhosis increased significantly, and Gremlin1 was an important factor of promote hepatic fibrosis. Gremlin1 and NT-proBNP displayed the potential value in the diagnosis and prognosis of liver fibrosis.

Gremlin1; NT-proBNP; liver Fibrosis; immunohistochemistry; immunofluorescence quantification

贾薇(1987～)女，黑龙江大兴安岭人，在读硕士研究生，医师。

张沛怡(1958～)女，黑龙江哈尔滨人，主任医师，硕士研究生导师。E-mail:zhangpeiyi@hotmail.com。

R

A

1008-0104(2015)02-0128-03

2014-11-20)