Ki-67与RAB5A在胃癌中的表达①

魏微微，孟凡石，张世英，魏亚青

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

Ki-67与RAB5A在胃癌中的表达①

魏微微，孟凡石，张世英，魏亚青

(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

目的:探讨胃癌中Ki-67与RAB5A在胃黏液腺癌中的表达情况，从分子水平探讨Ki-67和RAB5A与胃黏液腺癌分化程度以及浸润转移的相关性，为胃黏液腺癌的早期诊断和治疗提供一种更加敏感和可靠的依据。方法：应用过氧化物酶标记链霉卵白素法(S-P法)来检测18例印戒细胞癌和42例胃黏液腺癌、22例正常胃黏膜组织中Ki-67和RAB5A蛋白的表达水平及之间的相关性。通过免疫组织化学检测并结合患者的性别年龄、肿瘤组织浸润分化程淋巴结转移以及腹膜种植等情况对胃黏液腺癌以及癌旁3.0cm组织和正常组织进行综合分析。结果：Ki-67和RAB5A免疫反应阳性细胞为棕黄色，多数存在于细胞质或细胞膜。按照临床病理分析结果表明：Ki-67和RAB5A的表达与侵润深度、淋巴结转移和腹膜种植有着密切的关系,而与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)。侵及浆膜组Ki-67和RAB5A蛋白的阳性表达率分别为89.8%和95.9%，而未侵及浆膜组织Ki-67和RAB5A蛋白的阳性表达率分别为64.3%和57.1%，比较结果有显著性差异(P<0.01)；淋巴结转移组的Ki-67与RAB5A蛋白的阳性表达率分别为87.9%和90.9%，而无淋巴结转移组的Ki-67与RAB5A蛋白的阳性率为66.7%和63.7%，两者比较结果差异显著(P<0.05)；有腹膜种植的Ki-67和RAB5A蛋白的阳性分别为79.3%和86.2%差异较明显(P<0.05)，无腹膜种植情况Ki-67和RAB5A蛋白的阳性分别为77.4%和70.9%，差异无显著性(P>0.05)。结论：Ki-67和RAB5A可能与胃黏液腺癌的发生和发展有密切的关系；胃黏液癌中存在Ki-67和RAB5A表达上调，临床上可以通过检测Ki-67和RAB5A提高胃粘液腺癌早期诊断和早期治疗的敏感性。

Ki-67；RAB5A；胃癌；免疫组化

胃癌是人类最常见的恶性肿瘤中的一种，居全世界肿瘤发病率和癌症死亡率的第二位[1]，因胃癌死亡每年大约有70万人，中国则占其中的42%，严重危害到了人类的生活健康。近年来，胃癌的发病率逐年递增，采用手术治疗、化疗、放疗以及其他辅助疗法效果均不理想。胃黏液腺癌(MucinousGastricCarcinoma，MGC)具有非常强的局部浸润性，容易发生转移和扩散，特别是容易种植转移到腹腔各个器官，是胃癌之中比较少见的病理分型之一[2]。因此，对研究MGC浸润转移机制和MGC早期诊断治疗研究具有重要意义。

MGC的侵袭转移涉及到肿瘤细胞与宿主细胞之间的一系列的相互作用以及某些基因的异常表达，并同时受多种细胞因子的影响和调控，同时伴有细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的降解，使肿瘤细胞与细胞间黏附松解而解脱出来，通过溶蛋白过程进人周围的ECM，再进入血管和淋巴管，是一个分为多阶段的、多步骤的复杂生物学过程[5，6]。目前，从单一因素抑制胃癌黏液腺癌细胞的浸润与转移难以取得理想疗效，Ki-67和RAB5A在肿瘤浸润转移的过程中具有协同效应[7，8]。本研究采用免疫组化S-P法检测胃黏液腺癌及其癌旁3.0cm组织和正常胃黏膜组织中Ki-67、RAB5A的表达水平，探讨二者联合因素对胃黏液腺癌发生浸润转移的机制，寻求抑制胃癌细胞浸润转移提供一种可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 样本采集和标本制作

收集佳木斯大学附属第一医院普外科手术切除胃黏液腺癌标本60例其中含有18例印戒细胞癌和22例正常胃黏膜组织的，时间为2012-12～2013-12期间住院患者。选取目标部位用100mmol/L的福尔马林溶液固定24h后对组织块进行修整，然后依次放入AF液、酒精、松节油、浸蜡后再进行包埋处理，修整蜡块后备用。

1.2 主要试剂及设备

鼠抗人Ki-67单克隆抗体、兔抗人RAB5A单克隆抗体、SPN免疫组化试剂盒、RM-2135型石蜡切片机、BX51型电子显微镜、W21-600型电热恒温水浴箱、QP-BZ切片漂烘温控仪等。

1.3 实验方法

1 蜡块切片制备2二甲苯脱蜡、梯度酒精、PBS冲洗3阻断内源性过氧化物酶的活性4热修复抗原5加10%正常山羊血清(PBS稀释)6加适当比例PBS稀释的一抗7加生物素标记的二抗(1%BSA-PBS1:300稀释)8加辣根酶标记链酶卵白素9DAB显色，显微镜下观察统一控制显色时间10苏木精复染：脱水、透明、封片。

1.4 结果判断

Ki-67和RAB5A免疫反应阳性细胞为棕黄色，主要存在于细胞质或细胞膜。每张切片选择8个目标高倍视野，根据Ki-67阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为3级：无阳性着色或阳性细胞数<10%为阴性(一)；阳性细胞数在10%～50%为阳性(+)；阳性细胞数>50%为强阳性()。

1.5 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行χ2，P<0.05为有明显差异，P<0.01为有极显著差异Ki-67、RAB5A之间的相关性用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 胃黏液癌、癌旁组织及正常黏膜组织中Ki-67的表达

Ki-67蛋白阳性染色多数定位在细胞膜和细胞质上，镜下观察呈黄色或黄褐色颗粒。Ki-67蛋白主要表达于胃黏液癌细胞胞质中。Ki-67在胃癌组织的阳性表达率显著高于癌旁组织和黏膜组织(P<0.01)。而在癌旁组织和正常黏膜组织中的Ki-67表达均无显著差异(P>0.05)。Ki-67表达在印戒细胞癌的表达明显高于黏液癌中的表达，见表1。

表1 胃黏液癌、癌旁组织及正常黏膜组织中Ki-67的表达

＊与正常组比较P<0.01；▲与癌旁组比较P<0.01。

表2 Ki-67在胃TWIK液癌的表达与临床病理因素的关系

2.2Ki-67在胃黏液癌的表达与临床病理因素的关系

Ki-67的表达在胃黏液腺癌的患者中与其性别、年龄、肿瘤大小无关系(P>0.05)，但与浸润深度、淋巴结转移和腹膜种植与Ki-67蛋白的表达有紧密关系，见表2。

2.3 胃黏液癌、癌旁组织及正常黏膜组织中RAB5A的表达

位于细胞浆或细胞膜上RAB5A主要呈阳性染色，镜下可见呈黄色或黄褐色颗粒，表达呈阳性。在胃黏液癌、癌旁组织及正常黏膜组织RAB5A的表达，见表3。

表3 胃黏液癌、癌旁组织及正常黏膜组织中RAB5A的表达

＊与正常组比较P<0.01；▲与癌旁组比较P<0.01。

2.4RAB5A在胃黏液癌的表达与临床病理因素的关系

RAB5A在胃黏液癌中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小都没有关系(P>0.05)，但与浸润深度、淋巴结转移和腹膜种植情况与RAB5A蛋白的表达有紧密关系。RAB5A蛋白的阳性表达率浸及浆膜组织95.9% 、未及浆膜组织57.1%，两者差异极显著(P<0.01)；RAB5A蛋白的阳性表达率有淋巴结转移89.8% 、无淋巴结转移63.7%，两者差异比较显著(P<0.01)；RAB5A蛋白的阳性表达率有腹膜种植情况86.2% 、无腹膜种植情况70.9%，两者差异显著(P<0.05)，见表4。

表4 RAB5A在胃黏液癌的表达与临床病理因素的关系

2.5Ki-67和RAB5A在胃黏液癌的表达与临床病理因素的关系

表5 Ki-67、RAB5A表达水平与胃黏液腺癌临床病理特征的关系

从表5可以看出Ki-67和RAB5A在胃黏液腺癌的表达有所差别，在胃黏液癌中Ki-67和RAB5A的阳性表达率分别为76.2%和85.8%，两者比较有明显差异(P<0.05)，RAB5A的阳性表达，对侵及浆膜、有淋巴结转移和有腹膜种植情况的胃黏液癌的表达要明显高于Ki-67的阳性表达。Ki-67的阳性表达，对未侵及浆膜、无淋巴结转移和无腹膜种植情况的胃黏液癌的表达要明显高于RAB5A的阳性表达。因此，可以通过检测Ki-67和RAB5A的蛋白表达提高胃黏液腺癌诊断。

图1 胃癌组织中Ki-67的表达(SABC 200×)

图2 胃癌组织中RAB5A的表达(SABC200×)

3 讨论

胃黏液癌伴有黏液分泌增多，具有癌性的黏液容易溶解周围间质成分，是胃黏液胃癌侵袭性高的主要原因[9，10]。据实验结果分析表明：在胃黏液癌和印戒细胞癌中Ki-67表达有显著差异，印戒细胞癌中的表达高于胃黏液癌，这就说明了Ki-67可能是肿瘤分化差的重要标志[14]之一，在未浸及浆膜的胃黏液癌中Ki-67的表达则低于浸润到浆膜层的表达，这也说明了Ki-67可能与肿瘤的浸润深度密切有关。而在有淋巴结转移的组织中Ki-67表达且高于无淋巴结转移[11]，同时说明了Ki-67可能是肿瘤转移进展的标志之一。 肿瘤转移是多步骤而又复杂的过程，肿瘤细胞要发生转移[15]首先必须具有破坏周围基质及脉管基底膜屏障的能力。Ki-67作为MMPs家族中的重要成员，是一种促进肿瘤浸润、转移的蛋白水解酶。Ki-67作为降解基膜和细胞外基质主要结构的关键酶[16]，对恶性肿瘤的发展起着决定性的作用。Ki-67是在肿瘤组织间质细胞中合成的，Ki-67的表达量的增加[3～4]，使基膜和细胞外基质结构被降解破坏，为肿瘤细胞的移动提供了条件。

据研究报道表明，在正常胃黏膜组织、癌旁组织及胃黏液癌组织中RAB5A的表达呈现逐渐增长的趋势，由此结果可以得出在胃黏液腺癌的发生、浸润程度、淋巴结转移[12，13]情况以及腹膜种植情况等都可能与RAB5A的表达增长密切关系。据实验结果分析提示在胃黏液癌和印戒细胞癌中RAB5A表达有显著性差异，印戒细胞癌中的表达显著高于胃黏液癌，这就表明RAB5A可能是肿瘤分化差的重要标志之一。在未浸及浆膜的胃黏液癌中RAB5A的表达低于浸润到浆膜层的表达，这说明了RAB5A可能与肿瘤的浸润深度有着密切关系。在有淋巴结转移的组织中RAB5A表达高于无淋巴结转移，说明了RAB5A可能是肿瘤转移进展的标志。

[1]徐庵,王建明.胃癌流行病学研究[J].中华肿瘤防治杂志,2006,13(1):11-17

[2]RoderDM.TheePidemiologyofgastrieeaneer[J].GastrieCaneer,2002,5(suPPll):5-11

[3]王成俊,杨建平.胃癌 468 例相关因素分析[J].长治医学院报,2000,14(2):111-112

[4]TzanakisNE,PerosG,KarakitsosP,etal.Prognosticsignificanceofp53andKi67proteinsexpressioninGreekgastriccancerpatients[J].ActaChirBelg，2009，109(5): 606-611

[5]陈新文,黄忠诚,蒋才建.等.中青年与老年胃癌的临床特征对比分析[J].临床医学,2006,26(12):50-51

[6]张文范,张荫昌,陈峻青.胃癌[M].第2版.上海:上海科学技术出版社, 2001，76-127

[7]王靖,王成峰,赵平,等.早期胃癌的诊断与外科治疗[J].中国临床医生,2003,31(6):22-23

[8]徐细明,周中银,杨继元.消化系统恶性肿瘤的诊断与治疗[M].北京:科学出版社,2009，362-363

[9]YerushalmiR,WoodsR,RavdinPM,etal.Ki67inbreastcancer:prognosticandpredictivepotential[J].LancetOncol，2010，11(2): 174-183

[10]HeatleyMK.Ki67protein:theimmaculatedeception[J].Histopathology， 2002，40(5):483

[11]TzanakisNE,PerosG,KarakitsosP,etal.Prognosticsignificanceofp53andKi67proteinsexpressioninGreekgastriccancerpatients[J].ActaChirBelg，2009，109(5):606-611

[12]蔡颖，蔺玉昌．胃癌p53和Ki-67表达与淋巴结转移的相关性[J]． 齐齐哈尔医学院学报，2001，22(11):1236-1237

[13]易伟，胡志前，龚振斌．Ki-67 抗原和p53蛋白在胃癌中的表达及其临床意义[J]．中国普通外科杂志，2006，15(9):664-667

[14]陈福军， 于海涛，赵斌，等.CD44V6和RAB5a在结肠癌中的表达和相关性研究[J]．黑龙江医药科学，2012,35(3)：49

[15]OshimaCT，IriyaK，ForonesNM．Ki-67asaprognosticmarkerincolorectalcancerbutnotingastriccancer[J]．Neoplasma，2005，52(5):420-424

[16]LanzettiL,PalamidessiA,ArecesL,etal.Rab5isasignallingGTPaseinvolvedinactinremodellingbyreceptortyrosinekina-ses[J].Nature, 2004, 429 (6989): 309-3141

The research of Ki - 67 and RAB5A expressions in gastric cancer

WEIWei-wei，MENGFan-shi，ZHANGShi-ying，WEIYa-qing

(Clinical School of Medicine, Jiamusi University，Jiamusi 154003,China)

Objective: To study the expression of Ki-67 and RAB5A in mucinous gastric carcinoma. The correlation among Ki-67 and RAB5A and lymph node metastasis in invasive depth and degree of differentiation infiltration of mucinous gastric carcinoma were tested from molecular level, which provides a more sensitive and reliable basis for the early diagnosis and treatment of mucinous gastric carcinoma. Methods: S-P immunohistochemical technique is used to examine the expression and relation of Ki-67 and RAB5A in 42 cases of mucous gastric carcinoma, 18 cases of a signet-ring cell carcinoma and 22 cases of normal gastric tissues. The mucinous gastric carcinoma, 3.0cm adjacent tissue and normal tissues were comprehensively analyzed by immunohistochemical detection combined with gender, age, tumor size, lymph node metastasis in invasive depth, the differentiation of tumor infiltration, and distant metastasis of mucinous gastric carcinoma. Results: The color of the immune positive products of Ki-67 and RAB5A was buffy and mostly located in cytoplasm or plasmalemma. Clinical pathologic analysis results showed that the expressions of Ki-67and RAB5A had no significant differences in age, sex, and the size of tumor (P>0.05).Thelymphnodemetastasisininvasivedepthandthedegreeofdifferentiationhavesignificantdifferencesbetweenmucinousgastriccarcinomaandsignet-ringcellcarcinoma.TherateofpositiveexpressionofKi-67andRAB5Ainserosastratumwas90.1%and96.7%.Butthepositiveexpressionsoutofserosastratumwere64.3%and57.1%.TheexpressionsofKi-67andRAB5Awerehigheringastriccarcinomawithlymphnodemetastasisthanthosewithoutlymphnodemetastasis.Therateofpositiveexpressionwere87.9% , 90.9%and66.7%, 63.7%respectively(P<0.05).TheexpressionofKi-67andRAB5Awere79.3%and86.2%ingastriccarcinomawithPeritonealplanting,andtherateofpositiveexpressionwere77.4%and70.0%,respectively(P<0.05).Ki-67andRAB5AhadnosignificantdifferencesinnoPeritonealplanting(P>0.05).Conclusion: Ki-67 and RAB5A have close relations with the emergency and development of mucous gastric carcinoma. It is raised that there are Ki-67 and RAB5A expressions in gastric carcinoma, which can improve the sensitiveness of stomach mucus gland cancer diagnosing in early days and early treatment through measuring Ki-67 and RAB5A.

Ki-67; RAB5A; mucous gastric carcinoma; immunohistochemistry

魏微微(1980～)男，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，住院医师。

R

A

1008-0104(2015)02-0118-04

2014-10-26)