异丙酚预处理对拟阿尔茨海默病模型大鼠神经行为学和p38和caspase-3的影响①

邓 萌，王景霞，张 岩，余立荣，邓文伟

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

异丙酚预处理对拟阿尔茨海默病模型大鼠神经行为学和p38和caspase-3的影响①

邓 萌1，王景霞2，张 岩3，余立荣3，邓文伟3

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学口腔医院，黑龙江 佳木斯 154002)

异丙酚；阿尔茨海默病；大鼠；caspase-3

阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是老年人中发病率高、危害性大的中枢神经系统退行性疾病，其确切病因和发病机制尚不完全清楚。异丙酚(propofol)为目前最为常用的静脉全麻醉药物,因其苯环上的结构与天然的抗氧化剂维生素E相似,因而具有一定的清除自由基和抑制脂质过氧化作用[1],一些在体动物实验表明异丙酚具有脑保护效应[2～5]。本研究利用拟AD大鼠模型,观察了用异丙酚预处理海马组织中p38及caspase-3表达的影响,并结合行为学检测,评价异丙酚的脑保护作用。

1 材料和方法

1.1 材料

选择大连医科大学动物实验中心提供清洁级Wistar大鼠50只；体重(225±25)g，随机分为4组：青年组10只、假手术组12只、模型组14只、异丙酚组14只；标准喂养，自由饮水。除青年组大鼠外，其他各组按照60mg/kg体重腹腔连续注射D-半乳糖42d后，行手术。手术前检测水迷宫，按照380mg·kg-1体重腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，前囟后3.8mm，中线右2mm，脑表面进针3mm，缓慢注射2min，假手术组注射生理盐水2μL，Aβ对照组、异丙酚组大鼠注射2μL凝聚态Aβ1-40(10μg·μL-1)，留针10min，缓慢拔出，缝合切口，术后大鼠在低温下苏醒。15d后，行水迷宫检测，然后断头处死，取脑组织备用。异丙酚预处理组大鼠于拟AD模型制作前30min,腹腔注射异丙酚100mg/kg,对照组、拟AD模型组用同样方法腹腔注射生理盐水。

1.2 大鼠行为学检测

采用1984年提出的Morris水迷宫法用于评价空间学习记忆能力的指标。每天训练5次，持续6天，在第7天后24h内进行空间探索实验，记录60s内大鼠跨越平台相应位置的次数等，作为空间探索能力的指标。观察记录大鼠自入水到找到平台所游路径，所需要的时间(即逃避潜伏期)作为学习和记忆成绩。本实验中Morris水迷宫检测分别在D-半乳糖注射42d、手术后15d后进行，其中Aβ注射后学习记忆成绩下降30%以上的大鼠为AD造模成功。

1.3 标本采集和准备

大鼠于乙醚麻醉后，采用主动脉插管，生理盐水灌洗后，再用10%多聚甲醛灌注约30min，至组织变白后，在前囟后4mm处脑组织行石蜡包埋，SABC法免疫组化染色检测p38、caspase-3。

1.4p38、caspase-3表达的检测

在光镜下，p38、caspase-3阳性细胞为胞浆呈棕黄色。阳性细胞分布区随机选取5个不重叠的高倍视野(×400)，在病理图像分析仪下分别计数每个视野中的阳性细胞数，计算阳性细胞率(阳性率=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%)。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠造模前后及给药后逃避潜伏期的测定

大鼠连续腹腔注射D-半乳糖42d后(手术前)，行注射Aβ后(手术后)，大鼠在定位航行中的逃避潜伏期(寻找平台时间)检测，见表1。

表1 大鼠逃避潜伏期的变化及异丙酚对其影响±s)

注：与手术前比较※P<0.05，※※P<0.01；与假手术组比较

△P<0.05，△△P<0.01；与Aβ对照组比较▲P<0.05；与青年组比较■P<0.01。

表2 AD模型大鼠跨越平台次数及异丙酚对其影响±s)

2.2 大鼠经过平台及有效区次数的检测

AD模型制作前后大鼠在空间探索实验中跨越

平台及有效区次数测定结果，见表2。

假手术组、Aβ对照组、异丙酚组大鼠跨越平台次数较青年组明显减少(P<0.05)；模型制作后Aβ对照组和异丙酚组大鼠跨越平台次数组间无显著差异(P>0.05)，且均显著少于手术前(P<0.01)，而且较假手术组均有显著差异(P<0.01)；异丙酚组大鼠显著增加平台跨越次数，与Aβ对照组比较有显著差异(P<0.05)。

2.3 海马CA1区p38和caspase-3表达

见表3。

表3 各组海马CA1区p38和caspase-3阳性细胞率

与青年组和假手术组相比，p38阳性细胞率明显增多，有明显的统计学差异(P<0.01)。异丙酚组与模型组相比，p38阳性细胞率下降，有明显的统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

凋亡发生是一个复杂的由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程[6]。在caspase家族中，caspase-3 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[7]。多种刺激因素启动的信号激活caspase-3 使胞质、胞核及细胞骨架的主要蛋白质降解失活，caspase-3 在神经元凋亡中扮演着关键分子的角色，其在胞质激活，迅速转移到胞核执行凋亡。Morris水迷宫是目前评价空间学习与记忆能力最广泛使用的方法，主要检测与海马结构相关的记忆功能，对AD动物模型尤为适用[8]。本实验显示，与假手术组、异丙酚干预组相比，模型组上台潜伏期延长，穿越原平台次数下降，说明Aβ对大鼠的空间记忆获取与保持能力具有损害，证明模型成功；异丙酚干预组与模型组比较，其上台潜伏期明显缩短，穿越原平台次数有显著的提升，提示异丙酚对于Aβ致AD大鼠的空间记忆获取与保持能力有明显的改善。本实验显示:模型组CA1区p38细胞阳性率增加，异丙酚组p38细胞阳性率降低。由此推测:Aβ1-40的沉积促进p38的活化，p38的活化可磷酸化tau蛋白、介导炎症、凋亡反应及通过介导IL-1使突触泡蛋白的合成减少，导致AD发生、发展。异丙酚可能通过抑制p38的活性，保护神经元、改善学习记忆能力。 本研究结果表明,拟AD模型建立前30min异丙酚预处理能改善拟AD模型大鼠学习记忆能力,降低p38和caspase-3的表达,可能通过抑制细胞凋亡而发挥脑保护作用。

[1]MurphyPG,MyersPS,DaviseMJ,etal.Theantioxidantpo-teotialofpropofol(2,6-diiosoproopylphenol) [J].BrJAnaesth, 1992,68(6):613-618

[2]杨静,李天佐,张炳熙,等.异丙酚对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的影响[J].中华麻醉学杂志,2005,25(12):917-918

[3]KodakaM,MoriT,TanakaK,etal.Depressiveeffectsofpropofolonapoptoticinjuryanddelayedneuronaldeathafterforebrainischemiaintherat-comparisonwithnitrousoxide-oxy-gen-isoflurane[J].Masui, 2000,49(2):130-138

[4]甘国胜,姜立,陈利民,等.异丙酚预处理对全脑缺血再灌注大鼠损伤和神经行为学的影响[J].中国临床康复,2006,10(38): 79-81

[5]陈婷婷,王刚,周琪,等.异丙酚和异氟烷在瓣膜置换术中对脑保护作用的比较[J].中国体外循环杂志,2007,5(2):91-93

[6]AlbrechtS,BourdeauM,BennettD,etal.Activationofcaspase-6inagingandmildcognitiveimpairment[J].AmJPathol, 2007, 170(4):1200-1209

[7]RissmanRA,PoonWW,Blurton-JonesM,etal.Caspase-cleavageoftauisanearlyeventinAlzheimerdiseasetanglepathology[J].JClinInvest, 2004, 14(1):121-130

[8]朱秋双，任春清，包利泽，等.何首乌对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力的作用[J].黑龙江医药科学,2011,34(3): 8-9

黑龙江省教育厅科研项目，编号：12541791。

邓萌(1988～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

邓文伟(1963～)男，黑龙江佳木斯人，学士，教授，硕士研究生导师。E-mail:dengww@163.com。

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1008-0104(2015)01-0021-02

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