棉铃虫和烟青虫幼虫对植物次生代谢物质的味觉电生理反应和取食选择行为

汤清波，党 静， 詹 欢， 曹 欢， 赵新成， 闫凤鸣

(河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)



棉铃虫和烟青虫幼虫对植物次生代谢物质的味觉电生理反应和取食选择行为

汤清波，党 静， 詹 欢， 曹 欢， 赵新成， 闫凤鸣

(河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

为了研究棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)和烟青虫H.assulta(Guenée)2种近缘种昆虫寄主差异和寄主转移的味觉机制，本研究利用单感受器记录和叶碟法测定了棉铃虫和烟青虫5龄幼虫下颚栓锥感器对烟碱、辣椒素、棉酚和番茄苷等植物次生物质的电生理反应和取食选择行为。结果表明，棉铃虫幼虫中栓锥感器内存在对番茄苷和棉酚敏感的味觉神经元，而烟青虫侧栓锥感器和中栓锥感器内分别存在对辣椒素和烟碱敏感的味觉神经元。棉酚能够显著诱导棉铃虫5龄幼虫的取食选择行为，但是供试次生物质并不能显著影响烟青虫幼虫的取食选择行为。

棉铃虫；烟青虫；次生代谢物质；电生理反应；叶碟法

植食性昆虫接受或者拒绝寄主植物，一般首先由其外周感受器官上的味觉感器对植物初级和(或)次生代谢产物的信息进行探测，然后将探测信息传导至中枢神经系统进行综合判断[1,2]。鳞翅目幼虫口器的上唇、下颚须和下颚盔状突起上有多种味觉感器，主要通过这些感器中的味觉神经元来获得寄主的化学信息[3-5]。已有研究发现，一些专食性和寡食性的昆虫能够将寄主植物特有的次生物质作为识别和接受寄主的“ 标志性刺激物”(token stimulus)[6-8]，如在大菜粉蝶Pierisrassicae和菜粉蝶Pierisrapae幼虫口器上中栓锥感器和侧栓锥感器内，都存在1个芥子油苷(glucosinolates)受体神经元[4,6]，而烟草天蛾Manducasexta幼虫存在对茄科寄主植物次生物质——紫花茄皂苷(Indioside D)敏感的味觉神经元[7,8]，这些特异感受神经元的敏感性能够决定昆虫是否接受寄主或取食。棉铃虫Helicoverpaarmigera(Hübner)及其近缘种烟青虫Helicoverpaassulta(Guenée)是中国重要的农业害虫，这2种昆虫形态特征相似，在实验室条件下可以杂交[9]，幼虫对寄主的取食选择行为呈现典型的遗传性状[10]。但是2种昆虫的寄主范围却不同，棉铃虫是典型的多食性昆虫，其寄主涉及茄科、禾本科、豆科等30多个科200多种栽培和野生植物。其中重要的农作物包括棉花、番茄、玉米、小麦、烟草和豌豆等，而烟青虫是一种寡食性昆虫，其寄主仅限于茄科的烟草和辣椒等少数植物[11，12]。棉铃虫侧栓锥感器存在对蔗糖、中栓锥感器内存在对肌醇敏感的细胞[13,14]，为了探明幼虫栓锥感器的反应谱及其差异，本研究利用电生理技术和行为观察技术测定和比较了这2种昆虫对不同次生物质的电生理反应和取食选择行为，以期进一步了解近缘种昆虫寄主差异和寄主转移的味觉机制。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

供试棉铃虫和烟青虫虫源采自郑州市惠济区的河南农业大学科教园区，在室内进行人工饲养。饲养条件为温度(27±1)℃，相对湿度75%，光周期16L∶8D。幼虫人工饲料参照前人设计的配方[15]，并略加改进，用麦麸替代麦胚，并加入一定含量的蔗糖(表1)。测定时取棉铃虫和烟青虫5龄幼虫，分别进行试验。

1.2 供试仪器

利用顶端记录仪(Tip Recording)(Syntech, 荷兰)测定幼虫的味觉电生理反应。微动操作仪型号为MP-22( Syntech, 荷兰)。

1.3 供试试剂

氯化钾溶液购于天津市北辰方正试剂厂，脯氨酸、棉酚、烟碱、辣椒素、番茄苷购自Sigma公司；乙醇、甲醇购自天津市德恩化学试剂有限公司，聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinyl Pyrrolidone，PVP)(K30)购自天津市光复精细化工研究所，化合物均为分析纯。

表1 幼虫人工饲料配方Table 1 Components of artificial diet for Helicoverpa larvae

1.4 味觉电生理测定

味觉电生理反应的测定采用单感受器记录法(Single Sensillum Recording，SSR)[16,17]。测定时取进入5龄第2天的幼虫，饥饿约6 h，然后切去幼虫胸部第1胸节后的躯体，保留幼虫头部和第1胸节；将银丝一端弯成汤匙形，从幼虫胸部的切口处轻轻插入头部，银丝的另一端连接到味觉测量仪的微电极放大器探头上；利用微动操作仪将充满刺激物质溶液的玻璃电极轻轻套入幼虫栓锥感器顶端。栓锥感器内味觉细胞受到刺激后产生脉冲电位，经过放大器放大并由信号处理器处理，以数据形式保存在计算机上。

刺激化学物质共设置3个浓度梯度，分别为0.01、0.1、1 mmol·L-1。不同次生物质的稀释溶剂也不相同，其中棉酚溶剂为含有5%乙醚、5%甲醇和0.32%的PVP的2 mmol·L-1KCl溶液；番茄苷溶剂为5%乙醇、2%的甲醇和0.32%的PVP的2 mmol·L-1KCl溶液；辣椒素溶剂为0.25%的甲醇、5%的乙醇和0.32%PVP的2 mmol·L-1KCl溶液；烟碱溶剂为含0.16% PVP的2 mmol·L-1KCl溶液。

1.5 取食选择行为测定

取食选择行为测定采用经过改良的二项叶碟法[18]。根据电生理试验结果，选择电生理反应活性较强的次生物质，分别测试幼虫的取食选择行为。其中，棉铃虫测试棉酚(1 mmol·L-1)、辣椒素(1 mmol·L-1)和番茄苷(0.01 mmol·L-1)3种次生物质，烟青虫测试烟碱(1 mmol·L-1)和辣椒素(1 mmol·L-1)2种次生物质。

测试前采集新鲜的烟草叶片，用无菌蒸馏水冲洗干净并晾干后，用打孔器制备成直径1 cm 的叶碟。将叶碟分为处理和对照2组，处理叶碟用待测溶液浸泡，对照叶碟用相应的待测溶液的溶剂浸泡，浸泡时间均为10 min。测试时在直径12 cm的玻璃培养皿中放1张湿润滤纸，然后取处理和对照叶碟各4片，交叉放置在培养皿底部边缘，按照ABABABAB的顺序沿着培养皿四周排放，每2片叶碟之间的距离一致。最后选取5龄幼虫1头，放置在培养皿中央，并将培养皿置于光照均匀的人工气候箱内(温度25 ℃，湿度(75±5)%)，每隔30 min观察1次。当幼虫选择取食处理或对照叶碟面积的一半左右(即2片叶碟)时，将幼虫取出，用透明坐标胶片测量剩余叶面积。每组处理重复测定10头幼虫。

1.6 数据统计

电生理测定的电位信号用Autospike 3.7软件进行处理，用SPSS 17.0软件统计分析幼虫对不同处理和对照物质的反应频率，用Duncan新复极差法比较不同浓度的处理与对照物质之间的反应频率差异显著性检验(P<0.05)。

用取食选择指数来分析幼虫对处理和对照叶蝶的取食选择差异，取食选择指数的计算公式为：

处理叶碟的取食选择指数(PT)= 皿中处理叶碟的取食面积/皿中所有被取食的叶面积；

对照叶碟的取食选择指数(PC)= 皿中对照叶碟的取食面积/皿中所有被取食的叶面积。

用SPSS 17.0软件统计不同处理取食选择指数的平均数、标准差或标准误。用配对t测验分析不同幼虫对不同处理和对照叶蝶的取食选择差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 棉铃虫幼虫对植物次生代谢物质的电生理反应

棉铃虫幼虫栓锥感器对不同次生物质的电生理反应结果见图1。从图1-A可以看出，中栓锥感器对棉酚的电生理反应频率随溶液浓度的升高而增强，且3个浓度棉酚溶液诱导的反应频率差异显著(P<0.05)，而0.01 mmol·L-1棉酚诱导的反应频率与对照差异不显著(P>0.05)。与棉酚相反，幼虫中栓锥感器对番茄苷的反应强度随着浓度的升高而降低，且对0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1番茄苷的反应频率均高于1 mmol·L-1(P<0.05)，而0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1番茄苷诱导的反应频率差异不显著(P>0.05)。此外，中栓锥感器对不同浓度烟碱和辣椒素的反应频率均与对照差异不显著(P>0.05) 。所以，中栓锥感器对棉酚和番茄苷的浓度梯度反应表明中栓锥感器内存在对应的味觉受体神经元。从图1-B可以看出，棉铃虫幼虫侧栓锥感器对0.01 mmol·L-1和0.1 mmol·L-1烟碱溶液产生的反应频率均高于对照(P<0.05)，但1 mmol·L-1烟碱诱导的反应频率与对照差异不显著(P>0.05) 。而侧栓锥感器对0.01 mmol·L-1、0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1棉酚的反应频率之间差异不显著 (P>0.05)，且0.01 mmol·L-1和1 mmol·L-1棉酚诱导的反应频率显著高于对照(P<0.05)。侧栓锥感器对于3个浓度辣椒素的反应频率均与对照差异不显著(P>0.05)。这些结果表明棉铃虫侧栓锥感器不存在对这些次生物质敏感的特异味觉受体神经元。

A.中栓锥感器对不同浓度的烟碱、辣椒素、棉酚和番茄苷的电生理反应；B.侧栓锥感器对烟碱、棉酚和辣椒素的电生理反应。

A.Electrophysiological responses of medial sensillum to different concentrations of nicotine, capsaicine, gossypol and tomatine; B.Electrophysiological responses of lateral sensillum to different concentrations of nicotine, capsaicine and gossypol.

图1 棉铃虫幼虫栓锥感器对不同次生物质的电生理反应
Fig.1 Electrophysiological responses of sensilla styloconica ofH.armigeralarvae to different secondary plant substances

2.2 烟青虫幼虫对植物次生代谢物质的电生理反应

烟青虫幼虫栓锥感器对不同次生物质的电生理反应结果见图2。从图2可以看出，中栓锥感器对烟碱产生较高频率的电生理反应，其中对1 mmol·L-1烟碱的反应频率最高，达(105.50±27.50) 电位数·5 s-1，0.1 mmol·L-1烟碱溶液的反应频率相对较低，3个浓度烟碱诱导的反应频率均显著高于对照溶剂(P<0.05)。侧栓锥感器对3个浓度烟碱的反应频率均显著高于对照溶剂(P<0.05)，但3个浓度诱导的反应频率差异不显著(P>0.05)。侧栓锥感器对辣椒素也有较高的反应频率，从低浓度到高浓度逐渐增强，均显著高于对照(P<0.05)；比较3个浓度处理可以发现，0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1辣椒素的反应频率差异不显著(P>0.05)，但均显著高于0.01 mmol·L-1的反应频率(P<0.05)。这些结果说明烟青虫侧栓锥感器存在对辣椒素敏感的味觉受体神经元，而中栓锥感器存在对烟碱敏感的味觉神经元。

图2 烟青虫幼虫栓锥感器对不同次生物质的电生理反应Fig.2 Electrophysiological responses of sensilla styloconica of H.assulta larvae to different secondary plant substances

比较图1和图2结果可以看出，烟青虫幼虫侧栓锥感器对0.1 mmol·L-1和1 mmol·L-1辣椒素溶液的反应频率显著高于棉铃虫幼虫对相同浓度辣椒素溶液的反应频率(P<0.05)，而2种幼虫对0.01 mmol·L-1辣椒素溶液的反应频率差异不显著。说明烟青虫幼虫对辣椒素的敏感性要高于棉铃虫。烟青虫幼虫中栓锥感器对1 mmol·L-1烟碱的反应频率也显著高于棉铃虫幼虫，而对0.01、0.1 mmol·L-1烟碱的反应频率二者差异不显著。烟青虫幼虫侧栓锥感器对0.01、1 mmol·L-1烟碱的反应频率也显著高于棉铃虫幼虫，而2种昆虫对0.1 mmol·L-1烟碱的反应频率差异不显著(P<0.05)。这些比较结果说明烟青虫幼虫对烟碱的敏感性要高于棉铃虫。

2.3 棉铃虫和烟青虫幼虫对植物次生物质的取食选择行为

选择电生理活性较高的次生物质，分别测定棉铃虫和烟青虫幼虫的取食选择行为反应，得到图3结果。图3结果表明，棉铃虫幼虫对1 mmol·L-1棉酚处理叶蝶取食选择指数显著高于对照叶碟(P<0.05)，而对1 mmol·L-1辣椒素处理叶碟的取食选择指数与对照叶碟相比差异不显著(P>0.05)，对0.01 mmol·L-1番茄苷处理叶碟的取食选择指数与对照叶碟差异也不显著(P>0.05)。烟青虫幼虫对1 mmol·L-1辣椒素溶液的取食选择指数与对照差异不显著(P>0.05)，对1 mmol·L-1烟碱溶液的取食选择指数与溶剂对照差异也不显著(P>0.05)。这些结果说明番茄苷能够诱导棉铃虫幼虫的取食选择行为，而辣椒素并不能影响烟青虫幼虫的取食选择行为。

白色和黑色柱状体分别表示幼虫对次生物质处理的叶碟和对照叶碟的平均取食选择参数±SDE。 * 表示幼虫对处理和对照叶碟取食选择参数差异显著(P<0.05)，而ns表示差异不显著(P>0.05)。

White column and black column represents the mean ± SDE of feeding choice indexes to second plant substances treated tobacco leaf-disc and solvent-treated leaf-disc, respectively. Abbreviations: Go.:gossypol; Ca.:capsaicine; To.:tomatine; Ni.: nicotine; C.: non-chemical treated tobacco leaf-disc. *represents the significance of feeding choice indexes of larvae to different discs is significant (P<0.05), which ns is not significant (P>0.05).

图3 棉铃虫和烟青虫幼虫对几种次生物质的取食选择行为

Fig.3 Feeding preference for different secondary plant substances ofH.armigeraandH.assultalarvae using leaf-disc choices

3 讨论

3.1 棉铃虫和烟青虫幼虫的味觉受体神经元

植物的次生物质在昆虫的取食过程中起着重要的作用[19]，棉酚、烟碱、辣椒素和番茄苷分别是是棉花、烟草、辣椒和番茄等植物中的重要次生代谢物质。本研究发现，棉铃虫幼虫被番茄苷和棉酚诱导的电生理反应频率相对高，而烟碱和辣椒素诱导的反应频率相对较低。其中，棉铃虫幼虫中栓锥感器对棉酚的反应呈典型的浓度梯度反应，可以认为棉铃虫幼虫中栓锥感器中存在对棉酚敏感的细胞。番茄苷诱导的反应频率也相对高，且随着反应物浓度的升高反应频率逐渐降低，呈现逆浓度梯度反应，可以认为棉铃虫幼虫中栓锥感器中也存在对番茄苷敏感的细胞。棉铃虫对棉酚的正浓度梯度反应和对番茄苷的逆浓度梯度反应可以认为幼虫中栓锥感器中对棉酚和番茄苷敏感的细胞非同一细胞。而烟碱和辣椒素诱导的反应频率均较低，且反应均非浓度梯度反应，推测与中栓锥感器中不存在对烟碱和辣椒素敏感的细胞有关。棉酚和烟碱在侧栓锥感器诱导的反应频率均较低，且不呈浓度梯度反应，推测棉铃虫幼虫侧栓锥感器中不存在对烟碱和棉酚敏感的细胞。

烟青虫幼虫中栓锥感器和侧栓锥感器均对烟碱产生较高频率的电生理反应，其中，中栓锥感器对烟碱的反应呈现一定的浓度梯度反应，但3个浓度烟碱在侧栓锥感器诱导的反应频率差异不显著，且反应频率相对较低。因此，烟青虫的中栓锥感器对烟碱更加敏感。侧栓锥感器对辣椒素产生较高频率的电生理反应，且呈现典型的浓度梯度反应。因此，烟青虫幼虫侧栓锥感器内可能存在对辣椒素敏感的细胞。

3.2 棉铃虫、烟青虫及其他鳞翅目昆虫味觉电生理反应和取食行为的比较

近年来，多食性的棉铃虫及寡食性的烟青虫逐渐成为研究鳞翅目昆虫近缘种昆虫食性、化学感受等特性进化的模式昆虫[20-25]。已有研究报道了棉铃虫和烟青虫幼虫对不同物质敏感的味觉受体神经元，如测定棉铃虫和烟青虫幼虫对单一浓度的蔗糖、肌醇、烟碱、棉酚、辣椒素等物质的电生理反应，发现侧栓锥和中栓锥感器内分别存在蔗糖受体神经元和肌醇受体神经元，但是这2种昆虫对次生物质的反应一般与对照差异不显著[26]，推测与测试浓度较低有关(一般小于0.01 mmol·L-1)。本研究利用梯度浓度测定幼虫对这些物质的电生理反应，确定了棉铃虫幼虫中栓锥感器存在对棉酚和番茄苷敏感的受体神经元，而烟青虫的中栓锥感器和测栓锥感器分别存在对烟碱和辣椒素敏感的受体神经元。此外，还有研究发现，棉铃虫中栓锥感器内存在对取食抑制素番木鳖碱(Strychnine)和毒毛旋花子甙K(Strophanthin-K)敏感的神经元[27]。这些对不同植物代谢物质敏感神经元的发现，对于了解昆虫的食性差异和转变具有重要的意义。

寡食性昆虫能够利用其寄主植物特有的次生物质作为识别和接受其寄主的“标志性刺激物”(Token stimulus)[4, 6-8]。烟草天蛾在自然界是取食茄科寄主的寡食性昆虫，实验室可以用非茄科植物叶片或包含非茄科植物的人工饲料饲养烟草天蛾幼虫，这些幼虫也未形成专化性取食行为；但是，当用其茄科寄主马铃薯叶片饲养这些非专化性幼虫后，幼虫栓锥感器内的味觉细胞对紫花茄皂苷(indioside D)高度敏感，且在行为上只取食含有紫花茄皂苷的茄科植物，而拒绝取食其他饲料，表明紫花茄皂苷是烟草天蛾取食茄科植物的标志性刺激物[7,8]。本试验的行为测定结果表明，番茄苷能够显著诱导棉铃虫幼虫取食，这与棉铃虫幼虫在自然界取食富含番茄苷的未成熟番茄果实的现象相符。但是对番茄苷的电生理反应表现为负梯度反应，所以推测较高浓度的番茄苷可能抑制幼虫的取食。

烟青虫幼虫对烟碱和辣椒素的敏感性高于棉铃虫，可能是由于烟碱和辣椒素是烟青虫自然界两大寄主中存在的次生代谢物，而且对这些次生物质敏感性较高。棉铃虫则很少在辣椒上取食，至于烟碱在棉铃虫取食中的作用目前则不明确。此外，电生理反应相对较强的烟碱和辣椒素均未对烟青虫幼虫表现出诱导取食作用，可能是由于这些物质并非诱导烟青虫取食选择其茄科寄主的标志性刺激物或者并非起决定性的作用，而诱导烟青虫幼虫选择其寄主的标志性刺激物是类似紫花茄皂苷或者其它诱导物质，还有待进一步研究。

3.3 初级或次生代谢物决定不同食性昆虫的行为

相对于前期研究报道的棉铃虫对蔗糖和肌醇的电生理反应[13,14]，棉铃虫和烟青虫幼虫对植物次生代谢物质的电生理反应强度弱于对蔗糖和肌醇的反应。大量研究表明，蔗糖和肌醇是促进昆虫取食的物质，而多数次生物质是取食抑制物质，那么这种差异是不是反映了次生物质在这些幼虫取食寄主的过程中的作用没有促食物质强。对于2种实夜蛾属Heliothis近缘种昆虫的研究表明，寡食性的Heliothissubflexa不但对次生物质电生理反应的阈值低于多食性的烟芽夜蛾Heliothisvirescens[28]，而且H.subflexa行为反应的最低阈值也低于多食性的烟芽夜蛾，但是这种行为差异不是由于外周味觉神经元的电生理反应频率引起，而可能是幼虫中枢神经系统的信息处理差异所导致[29]。本研究发现，寡食性的烟青虫侧栓锥感器对辣椒素和烟碱的敏感性要高于棉铃虫。但是，棉铃虫幼虫栓锥感器内可能并不存在典型的烟碱和辣椒素受体神经元，而且烟碱和辣椒素对烟青虫的行为诱导活性也不显著。那么，是否棉铃虫和烟青虫的取食机制如前人提出的鳞翅目昆虫假设，多食性昆虫幼虫对寄主的选择是植物初级代谢物质如糖类决定，而寡食性昆虫则由植物的次生代谢物质决定[4,30]。这还需要进一步测定棉铃虫和烟青虫对多种初级代谢物和次生物质的电生理及行为反应。

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(责任编辑：蒋国良)

Gustatory electrophysiology responses and feeding preference behaviors ofHelicoverpaarmigera(Hübner) andH.assulta(Guenée) larvae to secondary plant substances

TANG Qingbo， DANG Jing， ZHAN Huan， CAO Huan， ZHAO Xincheng， YAN Fengming

(College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The gustatory mechanism of host-difference and host-shift between two closed lepidopteran species,Helicoverpaarmigera(Hübner) andH.assulta(Guenée) were investigated by measuring the electrophysiology responses of sensilla styloconica and feeding preference behaviors of the 5thinstar larvae to nicotine, capsaicine, gossypol and tomatine using the tip recording and the leaf-disc choices bioassay. The results show the medial sensillum ofH.armigeraresponded to tomatine and gossypol strongly, suggesting active tomatine and gossypol neurons in medial sensillum. ForH.assultalarvae, the lateral sensillum responded to capsaicine and medial sensillum responded to nicotine, suggesting an active capsaicine neuron in lateral sensillum and a nicotine neuron in medial sensillum ofH.assulta. The gossypol could significantly induce the feeding preference ofH.armigeralarvae, while the tested secondary plant substances had no significant effects on the feeding preference behaviors ofH.assulta.

Helicoverpaarmigera；H.assulta；secondary plant substance； electrophysiological responses；leaf-disc choice

1000-2340(2015)01-0061-07

2014-03-19

国家自然科学基金项目(31272373)；河南省教育厅自然科学计划项目(2009B180009)

汤清波(1975-)，男，河南新野人，副教授，博士，主要从事昆虫生理研究。

S435.6

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