转锰过氧化物酶基因酵母的建立及其降解秸秆木质素能力的研究

王 娇，王秋文，尹清强，岳道友，常 娟，宋安东，党晓伟 ，刘洪兵(.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 000；.濮阳职业技术学院，河南 濮阳 7000；.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 000； .河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡 66000；. 泌阳县畜牧局，河南 泌阳 6700)



转锰过氧化物酶基因酵母的建立及其降解秸秆木质素能力的研究

王 娇1, 2，王秋文1，尹清强1，岳道友2，常 娟1，宋安东3，党晓伟4，刘洪兵5
(1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州 450002；2.濮阳职业技术学院，河南 濮阳 457000；3.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002； 4.河南德邻生物制品有限公司，河南 新乡 466000；5. 泌阳县畜牧局，河南 泌阳 463700)

为了提高锰过氧化物酶基因的表达产量，从黄孢原毛平革菌中获取锰过氧化物酶基因，并将其转化至毕赤酵母中。在液态发酵培养条件下，重组酵母与原始黄孢原毛平革菌所分泌的锰过氧化物酶活性分别为0.317 8 U·mL-1和0.197 2 U·mL-1(P<0.05)；重组酵母所表达酶的最适温度和pH值分别为40 ℃和4.5，与原始酶的生化特性基本一致。在含有玉米秸秆的液体培养基中，重组酵母对秸秆中木质素降解率达到24.09%，而黄孢原毛平革菌对木质素的降解率为16.53%(P<0.05)。

锰过氧化物酶；基因表达；毕赤酵母；木质素降解

中国每年所产的农作物秸秆约6亿t，由于缺乏有效的处理手段，大部分被焚烧和腐烂掉，造成严重的资源浪费和环境污染问题。因而，把秸秆转化为动物饲料和其他有价值的资源具有非常重要的社会和经济意义。为了提高农作物秸秆的利用率，首先要考虑的是如何来降解秸秆中的木质素。降解木质素的主要酶类有木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)。锰过氧化物酶(Manganese peroxidase) 是一个含铁血红素的氧化还原酶，主要由白腐真菌系和土壤枯草系这2个担子真菌系产生。MnP与Lip都含有血红素，具有糖基的胞外酶，又称血红素过氧化物酶。MnP底物为有机酸，先将Mn2+氧化为Mn3+，Mn3+与有机酸螯合，通过扩散离开酶活性中心,在H2O2存在时，氧化分解具有芳香环多聚体的木质素及木质素模型物，被认为是木质素降解的关键酶之一[1-3]。MnP最早是在1984年由KUWAHARA等在黄孢原毛平革菌培养液中获得[4]，在生物漂白、造纸业、食品业和饲料业等应用方面具有重要作用[2，5，6]。MnP基因是协同表达的，受底物、氮源、锰浓度和热应激等因素影响[7，8]。对MnP基因的异源表达研究已很多，在原核表达系统中，需在培养液中加入血红素才能诱导锰过氧化物酶基因的表达[9]。以酵母菌为宿主菌的异源表达，是在AOX启动子下进行的，有利于外源基因的高效表达[10]。农作物秸秆是一种潜在的非竞争资源，能否变秸秆为饲料是人们关注的问题[11]。本研究将黄孢原毛平革菌的MnP基因在毕赤酵母中进行异源表达，研究其对农作物秸秆中木质素的降解作用，为农作物秸秆的开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄孢原毛平革菌(No.5.776)购自中国科学院微生物研究所。感受态大肠杆菌DH5α、硅胶膜型TMPCR产物(DNA片段)纯化试剂盒、PMD19-T连接试剂盒等试剂盒，限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、限制性内切酶Bg1II、蜗牛酶均购自自宝生物工程有限公司。DNA marker、Amp、抗生素Zeocin、IPTG和X-gal均购自TaKaRa公司。巴斯德毕赤酵母X-33和表达质粒载体pGAPZαA均表达质粒pGAPZαA购自Invitrogen公司。

1.2 培养基

1.2.1 PDA培养基 称取可溶性淀粉0.6 g，葡萄糖2 g，酵母浸粉0.2 g，胰蛋白胨0.5 g，磷酸氢二甲0.5 g，硫酸镁0.03 g，溶于100 mL蒸馏水中。

1.2.2 LB培养基 称取胰蛋白胨1 g，酵母浸粉0.5 g，氯化钠1 g，溶于100 mL蒸馏水中，低盐LB培养基氯化钠加0.5%，如需要加抗生素Zeocin，待高压灭菌后冷却至50 ℃时再加Zeocin混匀。所含Zeocin质量浓度为100 mg·L-1。

1.2.3 YPD培养基 称取酵母浸粉1 g，胰蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，溶于100 mL蒸馏水中。

1.2.4 秸秆培养基 液体YPD培养基中加0.2%硫酸锰和1%的玉米秸秆，秸秆粒度为40～60目。

上述培养基若制成固体培养基，可在相应的液态培养基中加2%琼脂。所有培养基在121 ℃高压灭菌15 min，冷却至室温后备用。

1.3 锰过氧化物酶DNA提取及克隆

1.4 锰过氧化物酶基因在毕赤酵母中的表达

将上述鉴定克隆成功的目的基因通过EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切回收，再通过T4 DNA连接酶作用与表达载体pGAPZαA连接，连接产物再次转化至大肠杆菌DH5α，在含抗生素Zeocin(100 mg·L-1)的低盐LB固体培养基中培养鉴定。将携带有锰过氧化物酶基因的重组质粒用Bg1 II限制性内切酶线性化后电击转化毕赤酵母。点击转化条件为：1.6 kV，25 μF，200 Ω，电击时间4～10 ms。

1.5 转锰过氧化物酶基因酵母的产酶特性分析

1.5.1 微生物的培养 将黄孢原毛平革菌和转MnP基因毕赤酵母菌在秸秆培养液中培养，每个菌种做3个重复，于30 ℃下摇床培养，转速70 r·min-1。分别在培养24、48、72、96 h取样，离心取上清液得到粗酶液，酶活性测定选用愈创木酚法[12]。

1.5.2 不同温度处理粗酶液后酶活性测定 将上述2种粗酶液分别在20，30，40，50，60 ℃温度水浴20 min，迅速放在冷水中降温后测定MnP活性。

1.5.3 酶最适pH的测定 通过改变丙二酸缓冲液的pH，测定MnP在pH为3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5反应体系中酶活性的变化情况。

1.6 转锰过氧化物酶基因酵母对玉米秸秆中木质素降解率的影响

将黄孢原毛平革菌、转MnP基因毕赤酵母、X-33原始毕赤酵母和转空pGAPZαA质粒酵母按相同计量分别接种于含1%玉米秸秆的秸秆培养液中，每个处理分别做3个重复，在30 ℃和转速70 r·min-1条件下摇床培养48 h，在105 ℃下烘干称重，以不接种的空白培养基作为对照组。每瓶取样1.5 g左右，测定木质素含量，木质素含量测定方法参照“饲料中酸性洗涤木质素(ADL)的测定”。计算木质素含量的百分比，并且以空白作为对照，计算在发酵培养中，秸秆木质素的降解率[13]。

1.7 数据统计分析

试验数据以平均值±标准差表示，用SAS6.12统计软件中ANOVA进行方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1MnP基因的获得、载体构建及在毕赤酵母中的表达

MnP基因通过PCR反应扩增后，用电泳分析和纯化，经上海生工测序结果与在NCBI上公布的序列L29039.1进行Blast比对，同源性达到98%，克隆所得基因全长1 451 bp，编码361个氨基酸，蛋白相对分子量约为40.1 kD。目的基因与载体连接后，通过高压电击手段把目的基因转入到毕赤酵母中。为了验证MnP基因是否在重组酵母中存在和表达，首先提取重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物扩增，经电泳分析后发现，在约1500 bp处有清晰条带(图1)，说明MnP基因已成功导入巴斯德毕赤酵母X-33中。分别取含有MnP基因的重组酵母、含有空质粒子载体的重组酵母、原始巴斯德毕赤酵母X-33、黄孢原毛平革菌等四种菌的培养液，做SDS-PAGE蛋白凝胶电泳。结果表明，含有MnP基因重组酵母菌液在约40 kD处出现1个清晰条带(图2)，根据DNA测序结果，经软件预测锰过氧化物酶表达的蛋白分子量约为40.1 kD，说明锰过氧化物酶已成功地在重组酵母中表达。

泳道M: DNA marker DL5000; 泳道1:MnP基因条带。

Lane M: DNA marker DL5000; Lane 1: The bands ofMnPgene.

图1 重组酵母基因组PCR
Fig.1 PCR ofMnPgene from genomic DNA of recombinantPichiapastoris

M：蛋白Maker；1：黄孢原毛平革菌；2：重组酵母；3：原始X-33酵母；4：空质粒酵母；5：水。

Lane M: Protein maker; Lane 1:Phanerochaetechrysosporium; Lane 2: recombinantPichiapastoriswithMnPgene; Lane 3: The nativePichiapastorisX33; Lane 4: recombinantPichiapastoriswithoutMnPgene; Lane 5: water.

图2 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳
Fig.2 SDS-PAGE protein gel electrophoresis

2.2 重组酵母所表达的MnP生化特性和降解秸秆能力分析

2.2.1MnP活性检测及分泌规律 由表1可知，转MnP基因毕赤酵母产酶时间比黄孢原毛平革菌产酶要早，且转MnP基因酵母最高酶活性(48 h)比黄孢原毛平革菌产酶最高酶活性(72 h)要高(P<0.05)；而原始毕赤酵母和转空pGAPZαA质粒的毕赤酵母均未检测到酶活性。

2.2.2MnP的最适温度和pH值 如表2所示，黄孢原毛平革菌与转锰过氧化物酶酵母两者酶活性均在40 ℃酶活性最高 (P<0.05)，在20 ℃至30 ℃范围内，两者酶活性变化趋势基本一致，而30 ℃之后转锰过氧化物酶毕赤酵母酶活性上升幅度增加，40 ℃之后转锰过氧化物酶毕赤酵母酶活性降低幅度较大，两者在60 ℃均未测到酶活性。由表3可知，黄孢原毛平革菌和转MnP基因酵母两者的粗酶液最适 pH 均为4.5(P<0.05)。pH 为5.5时，黄孢原毛平革菌粗酶液有少量酶活性，而转锰过氧化物酶酵母的粗酶液未检测到酶活性，两者粗酶液酶活性在不同 pH 环境下变化趋势基本一致。

表1 不同时间段MnP酶活性的测定 Table 1 The determination of enzyme activity during different incubating time U·mL-1

注：同列内小写字母不同者表示差异显著(P<0.05)，同行内小写字母相同者表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note: The date followed by different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05), while the date followed by the same lowercase letters in the same row mean insignificant difference (P>0.05). The same as below.

表2 不同温度对Mnp酶活性的影响Table 2 The effect of different temperature on enzyme activity U·mL-1

表3 不同pH对Mnp粗酶液酶活性的影响Table 3 The effect of different pH on enzyme activity U·mL-1

2.2.3 在秸秆木质素降解率分析 由表4可知，通过液体发酵处理秸秆后比较，转MnP基因酵母处理的秸秆含木质素量最少，原始黄孢原毛平革菌次之，均低于原始X-33酵母和空质粒酵母。转MnP基因酵母处理的秸秆含木质素量与原始黄孢原毛平革菌相比差异不显著(P>0.05)，与原始酵母、空质粒酵母和空白处理相比差异显著(P<0.05)。与空白对照对比，转MnP基因酵母处理的秸秆木质素降解率为24.09%，原始黄孢原毛平革菌处理的秸秆木质素降解率为16.53%，两者差异显著(P<0.05)，并高于其他处理组(P<0.05)。

表4 不同菌株对玉米秸秆中木质素降解率的影响Table 4 Lignin degradation rates of corn straw

3 结论与讨论

重组酵母DNA的PCR检测及MnP的蛋白质电泳结果均证明MnP基因已成功地得到了表达，其酶蛋白的相对分子量大小与刘尚旭等[14]的报道基本一致，说明MnP基因在毕赤酵母中异源表达成功。余梅等[15]研究表明，MnP活性受碳源、氮源、盐浓度等影响，葡萄糖为最佳碳源，硫酸铵为最佳氮源，反应液中没有Mn2+时，氧化反应几乎不发生，Mn2+≤10 μg·L-1时，MnP酶活性随Mn2+浓度增加而提高，Mn2+≥10 μg·L-1时，会抑制MnP酶活性。本试验在测定产酶情况时，培养基中加适量的玉米秸秆粉和0.2% MnSO4均是为了诱导菌株产酶和MnP基因的表达。不过重组酵母与黄孢原毛平革菌在24 h前和96 h后均未测到酶活性，其原因是在微生物生长初期，主要是进行初级代谢，此时菌体生长繁殖占主导地位，无次级代谢产物产生；酶属于次级代谢产物，一般在微生物代谢的后期(平台期)产生。本研究MnP的最适温度和pH与大多数学者的研究结果一致，分别为35～55 ℃和pH3.5～4.5[16]。说明MnP经酵母表达后对酶的生化特性没有明显影响。

利用生物法降解木质素是通过各种微生物菌系产生木质素降解酶的作用，其关键是提高木质素酶活性。在培养过程中，重组酵母只产生MnP这一种与木质素降解相关的酶，而黄孢原毛平革菌还会产生LiP等与木质纤维素降解有关的酶，会与MnP产生协同作用。但在本试验中，在同等处理条件下，重组酵母对木质素的降解率达到24.09%，而黄孢原毛平革菌对木质素的降解率只有16.53%，可以说明黄孢原毛平革菌对木质素降解率低的原因是产MnP活性低，可能是由于酵母菌比黄孢原毛平革菌更容易在液体培养的环境下生长，其产酶性质相对较好所致。

本研究通过基因工程手段将来自于黄孢原毛平革菌的MnP基因转至毕赤酵母中，在液体发酵条件下，重组酵母的MnP活性高于原始的黄孢原毛平革菌，两种酶的最适温度和pH基本一致，重组酵母菌对玉米秸秆中木质素的降解率要高于黄孢原毛平革菌，说明利用基因工程菌来提高秸秆中木质素的降解率是可行的，为秸秆的深加工和利用奠定了基础。

[1] PAPINUTTI L, MARTINEZ M J. Production and characterization of laccase and manganese peroxidase from the ligninolytie fungusFomessclerodermeus[J]. J Chem Technol Biotechnol, 2006, 81(6): 1064-1070．

[2] 刘梦茹，付时雨，詹怀宇，等. 锰过氧化物酶应用的研究进展[J]. 林产化学与工业，2006，26(2): 112-116.

[3] 崔艳红，韩庆功，常魁珍，等. 木质层孔菌产锰过氧化物酶条件的优化及酶学性质研究[J]. 饲料工业，2012，33(12)：55-59.

[4] 赵士豪, 赵学库, 杨丽宁. 锰依赖过氧化物酶研究进展[J]. 安徽农业科学， 2007，35(4): 957-959.

[5] 李汉全，何江浔，陈胜军. 造纸工业中生物制浆和生物漂白技术研究[J]. 九江师专学报，2003，22(6): 20-24.

[6] 邱雁临. 纤维素酶的研究和应用前景[J]. 粮食与饲料工业，2001(8): 30-31.

[7] YANG Q X, YEDILER A, YANG M. Antonius Kettrup Decolorization of an azo dye. reactive black 5 and mnp production by yeast isolate:Debaryomycespolymorphus[J]. Biochem Engineer J, 2005, 24: 249-253.

[8] EICHLEROV I, HOMOLKA L, LISA L, et al. Orange G and remazol briliant blue R decolorization by white rot fungiDichomitusSqualens,IschnodermaresinosumandPleurotuscalyptratus[J]. Chemosphere, 2005, 60: 398-404.

[9] 杨金水，袁红莉，陈文新. 锰过氧化物酶(Mnp)的研究进展[J]. 生物技术，2003，13(2): 45-47.

[10] 胡 明，陆雪梅，高培基. 锰过氧化物酶的结构和功能[J]. 中国生物工程杂志， 2003，23(3): 30-34.

[11] 孙汉鸣. 木腐菌及其过氧化物酶在纸浆和煤炭生物处理方面的应用[D]. 济南: 山东大学，2005.

[12] 周金燕, 张发群，舒远才. 愈创木酚法测定锰过氧化物酶活力[J]. 纤维素科学与技术，1993，1(1): 34-37.

[13] SOEST, P J, ROVERTSON, J B, LEWIS B A, et al. Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition[J]. J Dairy Sci, 1991, 74: 3583-3597.

[14] 刘尚旭，赖 寒. 木质素降解酶的分子生物学研究进展[J]. 重庆教育学院学报，2001，14(3)：64-67.

[15] 余 梅，阮小文，谭丽泉，等. 白腐真菌产锰过氧化物酶的研究[J]. 化学与生物工程，2014，31(11): 40-44.

[16] 吴会广，蔡宇杰，苑博华，等. 锰过氧化物酶产生茵的发酵优化及酶学性质研究[J]. 食品与机械，2008(4): 17-21.

(责任编辑：蒋国良)

Study on establishment of recombinantPichiapastoriswith manganese peroxidase gene and its ability of degrading lignin in corn straw

WANG Jiao1,2, WANG Qiuwen1, YIN Qingqiang1, YUE Daoyou2, CHANG Juan1, SONG Andong3, DANG Xiaowei4, LIU Hongbing5
(1. Engineering College of Animal Husbandy and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2. Puyang Vocational and Technical College, Puyang 457000, China; 3. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;4. Henan Delin Biological Products Co., Ltd., Xinxiang 466000, China; 5. Beiyang Animal Husbandry Bureau, Beiyang 463700, China)

In order to enhance manganese peroxidase production，the manganese peroxidase gene was isolated fromPhanerochaetechrysosporiumand transformed intoPichiapastoris(X-33). Under the same conditions of liquid-state incubation for the recombinantPichiapastorisandPhanerochaetechrysosporium, manganese peroxidase activity was 0.317 8 U·mL-1and 0.197 2 U·mL-1, respectively (P<0.05). The optimal temperature and pH value of the expressed enzyme were 40 ℃ and 4.5, which was the same as the native enzyme. The liquid-state fermentation with corn straw showed that lignin degradation rates in corn straw were 24.09% and 16.53% for the recombinantPichiapastorisandPhanerochaetechrysosporium, respectively (P<0.05).

manganese peroxidase; gene expression;Pichiapastoris; lignin degradation

2015-06-23

郑州市科技创新团队(112PCXTD339)；河南省高校科技创新团队支持计划(15IRTSTHN014)

王 娇(1986-)，女，山西长治人，硕士，主要从事饲料生物技术研究。

尹清强(1964-)，男，河南南阳人，教授，博士。

1000-2340(2015)06-0817-05

S816

A