复配化学调节剂对水稻子粒灌浆充实和蔗糖-淀粉代谢关键基因表达的影响

彭 廷，万建伟，王琳琳，杜彦修，张 静，李俊周，孙红正，赵全志

(河南农业大学河南省粮食作物协同创新中心，河南 郑州 450002)



复配化学调节剂对水稻子粒灌浆充实和蔗糖-淀粉代谢关键基因表达的影响

彭 廷，万建伟，王琳琳，杜彦修，张 静，李俊周，孙红正，赵全志

(河南农业大学河南省粮食作物协同创新中心，河南 郑州 450002)

采用大田试验，以大穗型水稻品种新丰2号为试验材料，研究了抽穗期喷施复配化学调节剂对水稻子粒灌浆充实、稻米品质和蔗糖-淀粉代谢关键基因表达的影响。结果表明，外源喷施复配化学调节剂IV和V可增加水稻强势粒和弱势粒的起始灌浆势、相对起始势，提高最大灌浆速率和平均灌浆速率，缩短达到最大灌浆速率所需时间，显著改善强势子粒的外观品质和碾磨品质，提高水稻弱势子粒的千粒重，且强势粒和弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达均得到显著提高。因此，外源喷施复配化学调节剂IV和V可通过增加强势粒和弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达，进而提高水稻强势粒和弱势粒的灌浆充实、增加产量、改善稻米品质。

水稻；复配化学调节剂；灌浆充实；蔗糖-淀粉代谢关键酶基因；稻米品质

世界人口所需能量的21%，东南亚人口所需能量的76%均来自水稻[1]。大量的研究结果和生产实践均表明，水稻稻穗下部的弱势子粒灌浆充实度差已成为限制现代水稻品种产量和品质提高的关键因素[2-3]。因此，改善稻穗下部子粒的灌浆充实，对于提高水稻的产量和改善稻米的品质具有重要的战略意义。水稻子粒灌浆是一个复杂有序的动态变化过程，既包含蔗糖-淀粉代谢相关酶类及其基因的调控[4-6]，也受植物激素及其合成代谢相关基因调节[6-7]，研究表明，灌浆初期子粒库容活性低及灌浆中后期子粒中蔗糖转化为淀粉的效率低是造成弱势粒灌浆差的主要原因[3]。植物生长调节剂因其用量小、速度快、效益高等特点越来越多的被用在作物生产上[8-11]。研究表明，水稻灌浆初期，脱落酸可提高子粒中蔗糖合成酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶及淀粉合成酶等关键酶活性来促进淀粉合成，提高三磷酸腺苷酶活性来提高子粒中蔗糖的卸载能力，适当提高子粒中脱落酸含量，可提高子粒的灌浆速率，进而缩短灌浆时间；灌浆初期外源喷施低浓度脱落酸可增加千粒重、整精米率、降低垩白度[12]；外源喷施钴离子(乙烯生物合成抑制剂)，可显著增加水稻胚乳细胞的分化速率和子粒的灌浆速率及弱势子粒的千粒重[13]。在孕穗后期喷施复配植物生长调节剂PR1可增加弱势粒千粒重、精米率，并显著降低其垩白粒率[8]；在孕穗前期叶面喷施以硼砂为主的植物生长调节剂可有效提高柱头双外露率，提高异交结实率，从而提高产量[14]；在始穗期及齐穗期叶面植物生长调节剂促进子粒中蔗糖向淀粉的转化，加速子粒的灌浆充实[10]。作者前期筛选的复配化学调节剂IV和V可显著增加水稻子粒，特别是弱势子粒的千粒重，对提高水稻子粒的产量具有明显的效果[9]。本研究通过大田试验分析了外源喷施复配化学调节剂IV和V对水稻子粒灌浆充实和稻米品质的影响，探讨了复配化学调节剂IV和V提高水稻子粒灌浆充实的作用机制，以期为提高水稻产量和改善稻米品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2012年在河南农业大学科教园区进行，供试水稻品种为黄淮流域大面积推广的大穗型粳稻品种新丰2号，采用塑料软盘育秧，2012-05-05播种，2012-06-18移栽，移栽秧龄为五叶一心，栽插密度为30 cm×13 cm，大田灌溉采用井水，水分管理按常规进行。供试复配化学调节剂为作者筛选出的植物生长调节剂IV和V[9]，以喷施清水为对照，喷施时均加入吐温-80作为展布剂。随机区组设计，每试验小区面积为6 m×5 m，小区间隔0.5 m，保护行1 m，3次重复，及时防治病虫害，其他管理同一般高产田。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 样品的采集 抽穗期对各处理选择同一天抽穗开花、生长一致的植株进行挂牌标记，每小区标记400～500穗，于挂牌后第2天及第4天上午分别进行外源喷施，每小区喷施药液2 L，分别于处理后0，5，10，15，21，28，35 d选取标记穗，子粒分强势粒、弱势粒和中势粒储存。强势粒和弱势粒的取样方法参照作者前期研究结果[15]，强势粒为穗顶部的3个一次枝梗上的子粒(去其第2粒)，弱势粒为穗基部3个枝梗上的二次枝梗的子粒(去其顶粒)，中势粒为除去强势粒和弱势粒的子粒。一部分于105 ℃杀青30 min，80 ℃下烘干至质量恒定，用于强势粒和弱势粒的灌浆动态分析，另一部分于液氮中速冻，然后放入-80 ℃冰箱中保存，用于蔗糖-淀粉代谢途径关键酶基因表达量等指标的测定。

1.2.2 灌浆速率的测定 灌浆速率的测定参照朱庆森等[16]的方法，以Richards方程拟合子粒的灌浆过程，子粒质量(W)随开花后天数的变化用下列公式表示：

W=A(1+BE-KT)-1/N

式中：A为子粒最大生长量；BE，K，T，N为Richards方程参数。

1.2.3 蔗糖-淀粉代谢关键酶基因表达的测定 从MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/)数据库获取蔗糖-淀粉灌浆基因 cDNA序列，采用Primer Premier 5设计引物(表1)。强、弱势粒灌浆过程中子粒总RNA的提取用RNA提取试剂盒(TransGen Biotech, Tranzol Plant, ET1201-01)进行提取。反转录使用HiFi-MMLV cDNA Kit(康为世纪，CW0744A)。将反转录后的cDNA稀释20倍，取5 μL做模板，配置20 μL含有10 μL UltraSYBR mixture反应体系，以β-actin为内参基因，在BioRad iQ5仪器上进行实时荧光定量PCR，反应程序：95 ℃预保温10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。所有PCR均设置3次重复，相对表达量用2-△△Ct方法计算。

表1 实时定量PCR所用引物

1.2.4 考种 收获时，每小区随机选取具有平均穗数的稻株10穴，室内挂藏风干后用于考种。考种项目包括有效穗数、实粒数、空粒数、结实率、强势粒、弱势粒和千粒重。

1.2.5 子粒充实度 子粒充实度的测定参照朱庆森等[17]的方法。子粒充实度(%)=(受精谷粒千粒重/水选饱满谷粒千粒重)×100。

2 结果与分析

2.1 复配化学调节剂对水稻产量、构成因素及充实度的影响

复配化学调节剂IV和V对水稻产量及其构成因素的影响见表2。从表2可以看出，复配化学调节剂IV和V的实际产量分别比对照高出0.85，0.82 t·hm-2，增产幅度分别为8.35%，8.01%，且差异达到显著水平。进一步分析产量构成因素可知，喷施复配化学调节剂IV，V后，穗粒数、结实率与对照相比,虽有促进作用，但均未达到显著水平，而喷施复配化学调节剂IV和V后，强势粒和弱势粒千粒重分别比对照高出1.57%,0.03%，10.01%,7.66%；充实度分别比对照提高1.65%,0.12%，3.47%,2.34%，且均弱势粒千粒重和充实度与对照相比均达到显著水平。可见，复配化学调节剂IV,V处理提高水稻产量是通过提高水稻子粒的千粒重和充实度，特别是弱势粒的千粒重和充实度来实现的。

表2 复配化学调节剂对水稻产量构成因素的影响

注：同列数据不同的小写字母表示5%水平上的差异显著性。下同。

Note： The different lower case letters in the same column indicate significant difference at 5% level. The same as below.

2.2 复配化学调节剂对水稻子粒灌浆动态的影响

表3为Richards模型计算出的灌浆特征参数，图1为复配化学调节剂IV，V处理后强、弱势粒灌浆动态和灌浆速率的Richards模拟曲线。R0为灌浆起始势，反应了受精子房生长的潜势，与子粒生长初期的生长速率有着密切的关系，起始势越大，说明子粒灌浆启动得越早[16]。由表3可以看出，复配化学调节剂IV，V处理后强、弱势粒的起始势和相对起始势均高于对照，说明复配化学调节剂IV，V有助于子粒的启动灌浆。强势粒和弱势粒的最大灌浆速率和平均灌浆速率变化趋势相似，均为复配化学调节剂IV>V，且两处理均大于对照(表3，图1)；同样，复配化学调节剂IV，V处理后强、弱势粒达到最大灌浆时间提前，分别比对照提前0.289，0.196，0.196，0.684 d。灌浆程度达到99%的时间在强弱势粒间有所不同，强势粒表现为V，IV，对照依次延长；而弱势粒则为IV，对照，V依次延长。由此可见，复配化学调节剂IV，V处理提高了子粒灌浆起始势，增加灌浆速率，缩短最大灌浆速率时间及灌浆程度达到99%的时间，说明植物生长调节剂处理通过改善水稻子粒灌浆进程，从而最终提高了子粒的灌浆充实度。

表3 复配化学调节剂对水稻子粒灌浆过程的Richards方程特征参数

注：R0，灌浆起始势；R0/W0，相对起始势；Vmax最大灌浆速率；Tmax最大灌浆速率时间；T99子粒灌浆程度达99%的时间；V，平均灌浆速率。

Note：R0, initial grain filling potential;R0/W0,relatively initial grain filling potential;Vmax, maximum grain filling rate;Tmax, time reaching the maximum grain filling rate;T99, time of grain filling reaching 99%;V,mean grain filling rate.

图1 复配化学调节剂对水稻强势粒(A和C)和弱势粒(B和D)的子粒灌浆动态(A和B)和灌浆速率(C和D)的影响

2.3 复配化学调节剂对水稻稻米品质的影响

由表4可知，复配化学调节剂IV和V处理后，稻米品质相关指标比对照均有提高。就加工品质而言，外源喷施复配化学调节剂IV和V，强势粒的出糙率、精米率、整精米率均高于对照，不完善粒率低于对照，其中整精米率分别高于对照1.45%，1.09%，并达到显著水平；弱势粒的出糙率分别提高5.85%，5.88%，精米率分别提高13.83%，10.96%，整精米率分别提高20.09%，13.71%，且差异均达到显著水平(表4)。从外观品质看，强势粒中，IV，V的垩白粒率分别低于对照17.65%，17.44%，垩白度低于对照31.22%，29.56%，达到显著水平；弱势粒中，垩白粒率分别低于对照23.21%，7.09%，垩白度均低于对照12.50%，4.35%，IV的垩白粒率与对照达到显著水平(表4)。综上所述，外源喷施复配化学调节剂IV和V可提高稻谷出米率，减少不完善粒，降低垩白度，有效地改善稻米品质。

表4 复配化学调节剂对稻米加工品质和外观品质的影响

2.4 复配化学调节剂对水稻子粒蔗糖-淀粉代谢关键酶基因表达的影响

子粒中参与蔗糖-淀粉代谢途径中的酶有很多种，但起关键作用的酶，有蔗糖合成酶(SUS2，SUS3)、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADPG)、淀粉合成酶(SSI)、颗粒结合淀粉合成酶(GBSSI，GBSSII)；此外,尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP)，及2个转运因子腺苷二磷酸葡萄糖转运蛋白(BT)和6-磷酸葡萄糖转运蛋白(GPT)也被证明在此过程中有重要作用，其活性高低将直接影响淀粉的积累，进而影响子粒的灌浆充实[5,6,18]。由图2可以看出，强势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达随子粒的灌浆进程呈逐渐降低的变化趋势，外源喷施复配化学调节剂IV和V可显著增加灌浆初期(花后5 d)和后期(花后28～35 d)蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达；弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达随子粒的灌浆进程呈现增加后减少再增加的变化趋势，且外源喷施复配化学调节剂IV和V可显著增加整个灌浆期弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达。

图中的基因表达量经过log2处理。灰色与黑色表示基因表达量较高或较低。

3 讨论与结论

水稻子粒的主要成分为淀粉，淀粉合成及其积累速率的快慢直接决定了稻米产量的高低和品质的优劣。近年来的研究结果也表明，蔗糖-淀粉代谢关键酶的活性及其基因表达与水稻子粒灌浆充实的关系密切[5, 6, 18]。蔗糖合成酶(SUS)是蔗糖进入子粒后，催化其第一步反应的关键酶，可调控子粒的灌浆速率，其活性大小对淀粉合成有很大影响，是水稻子粒灌浆充实的限速酶[6,7]。灌浆初期SUS2和SUS3在强势粒中的基因表达量显著高于弱势粒，且蔗糖-淀粉代谢下游关键基因的表达量也显著高于弱势粒，说明灌浆初期蔗糖合成酶基因表达量低，进而导致蔗糖-淀粉代谢下游关键基因的表达量低是水稻弱势子粒灌浆充实差的原因，与灌浆初期子粒库生理活性低及活跃灌浆期蔗糖转化为淀粉的生化效率低是弱势粒灌浆充实差的重要原因一致[3]。本试验结果表明，外源喷施复配化学调节剂IV和V，不仅显著提高了灌浆初期强、弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达。与强势粒相比，复配化学调节剂IV和V对弱势粒蔗糖-淀粉代谢关键酶基因表达的影响更大，整个灌浆期弱势粒中蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达均得到显著提高，说明复配化学调节剂IV和V对调节水稻子粒蔗糖-淀粉代谢关键酶的活性具有重要作用。

外源喷施复配化学调节剂可显著提高水稻子粒的产量和灌浆充实度[9-11]。本试验结果证明，外源喷施复配化学调节剂IV和V，可显著提高水稻子粒，特别是弱势子粒的千粒重，增加水稻的产量，与前期研究结果一致[9]。此外，复配化学调节剂IV和V处理后提高了强、弱势粒灌浆起始势和平均灌浆速率，缩短了达到最大灌浆速率的时间；显著提高了弱势子粒的出糙率、精米率和整精米率；强、弱势子粒的外观品质也得到明显改善。由此可见，复配化学调节剂IV和V主要是通过提高水稻子粒，特别是弱势子粒的千粒重和灌浆充实度来增加水稻产量，改善水稻强、弱势粒的加工品质和外观品质的。有研究结果证明，抽穗期外源喷施复配化学调节剂IV和V，可显著增加不同叶位茎、鞘中可溶性糖含量和穗茎节间伤流量[9]。因此，在抽穗期喷施复配化学调节剂IV和V处理后，显著增加不同叶位茎、鞘中可溶性糖含量、增加穗茎节间伤流量，增加蔗糖-淀粉代谢关键酶基因的表达，促进子粒，特别是弱势子粒中蔗糖向淀粉的转化，进而影响子粒中淀粉的合成和积累，提高水稻产量、改善稻米品质。

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(责任编辑：常思敏)

Effect of chemical regulation compounds on rice grain filling,and sucrose-starch metabolism key enzyme related genes expression of rice

PENG Ting, WAN Jianwei, WANG Linlin, DU Yanxiu, ZHANG Jing,LI Junzhou, SUN Hongzheng, ZHAO Quanzhi

(Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

To detect the effect of chemical regulation compounds on rice grain weight, filling, and sucrose-starch metabolism key enzyme related genes expression of large panicle japonica rice, an open field experiment was conducted by spraying exogenous regulation compounds IV and V at heading stage using large panicle japonica rice varieties Xinfeng 2 as experimental materials. The result indicated that spraying exogenous regulation compounds IV and V not only could increase initial grain filling potential (R0), relatively initial grain filling potential (R0/W0), maximum grain filling rate (Vmax), and mean grain filling rate (V), but the time for superior and inferior grains to reach the maximum grain filling rate (Tmax) was decreased. The appearance quality of superior grains, and processing quality of inferior grains were significantly improved, and 1 000-grain weight of inferior grains were significantly increased. Furthermore, sucrose-starch metabolism key enzyme related genes expression of superior and inferior grains were enhanced as well. Therefore, the quality and 1 000-grain weight of superior and inferior grains were significantly increased after spraying exogenous regulation compounds IV and V at heading stage by enhancing sucrose-starch metabolism key enzyme related genes expression.

rice; exogenous regulation compounds; grain filling; sucrose-starch metabolism key enzyme related genes; rice quality

2015-08-17

国家自然科学基金项目(31271651)；河南省水稻产业技术体系项目(S2012-04-02)

彭 廷(1985-)，男，河南桐柏人，讲师，博士，主要从事水稻分子生理研究。

赵全志(1968-)，男，河南平舆人，教授，博士。

1000-2340(2015)05-0602-06

S 511

A