磷胁迫对烤烟高亲和磷转运蛋白基因表达及磷素吸收利用的影响

王艳丽，王 京，刘国顺，丁松爽＊，李建华

（1河南农业大学烟草学院／国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州450002；2河南省烟草公司许昌市公司，河南许昌461000）

磷胁迫对烤烟高亲和磷转运蛋白基因表达及磷素吸收利用的影响

王艳丽1，王 京1，刘国顺1，丁松爽1＊，李建华2

（1河南农业大学烟草学院／国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州450002；2河南省烟草公司许昌市公司，河南许昌461000）

为探明缺磷胁迫对烤烟磷吸收的影响机理，以烤烟品种‘豫烟10号’为材料，采用盆栽试验设置不施磷（-P）和正常供磷（＋P）2个处理，分析了烟草生育后期根系和叶片中高亲和磷转运蛋白基因NtPht1；1、NtPht1；2（简称PT1、PT2）的表达差异性及其表达量与烟草磷含量、磷积累量的关系。结果表明：（1）随生育期的推进，烤烟根系和叶片的PT1基因相对表达量、PT2基因相对表达量、干物质重和磷素积累量逐渐增加，烟叶的磷含量逐渐降低，根系磷含量无明显的变化规律。（2）磷胁迫促使PT1、PT2基因的表达量上调，其中叶片PT1基因的相对表达量高于根系，叶片PT2基因的相对表达量显著低于根系。（3）磷胁迫限制了烤烟对干物质和磷素的积累，在移栽后90d，-P处理烤烟根系和叶片的干物质重、磷素积累量不到＋P处理的一半，处理间差异极显著。研究认为，在缺磷环境下，烟草高亲和磷转运蛋白基因PT1和PT2表达量的增加，是由磷胁迫下烟草体内磷积累量降低所引起的系统性调控。

烤烟；磷胁迫；高亲和磷转运蛋白基因；磷素吸收利用

磷是重要的生命元素，是烤烟体内许多有机化合物的组成成分，与烤烟的新陈代谢和生长发育状况密切相关。烤烟吸收的磷以H2PO4-和HPO42-为主，肥料磷施入土壤后极易被固定，形成难以利用的矿物态，导致土壤总磷含量高、磷肥利用率普遍偏低。一般认为植物从土壤中吸收磷素是逆浓度梯度的主动耗能吸收过程，属于H2PO4-／H＋共运机理（Pht1家族）［12］，因此，土壤磷浓度的改变必然影响到烤烟对磷的吸收。郭燕等［3］认为烤烟磷含量与土壤速效磷含量呈极显著的正相关关系，即在一定范围内烤烟磷含量随土壤速效磷含量的升高而升高。

低磷胁迫下，植物根系形态发生一系列变化［4-5］的同时，也会通过增加根系分泌物、降低代谢消耗、增强缺磷诱导基因的表达等生理变化来吸收更多的磷营养［6-7］。其中，与磷酸盐吸收转运直接相关的基因就是烟草高亲和磷转运蛋白基因。目前已克隆出的烟草高亲和磷转运蛋白基因有5个，其中Nt-Pht1；1和NtPht1；2（简称PT1和PT2）基因受磷胁迫诱导表达上调，NtPht1；3、NtPht1；4和Nt-Pht1；5与菌根诱导有关［8］。关于植物Pht1家族磷转运蛋白基因的已有研究主要集中在基因的结构、功能以及表达调控方面［2，9］，在拟南芥、水稻等模式作物上研究较多，认为Pht1家族的磷酸盐转运蛋白主要存在于细胞质膜上［10］，负责低磷环境下植物根系从土壤中吸收磷素营养，并调节植物体内磷素向维管组织的转运过程［11-12］，基因的表达则受转录因子［13］、其他矿质营养水平、植物激素等因素共同调控［10］。尽管已知低磷调控高亲和磷转运蛋白基因的表达，但这种低磷信号来自于土壤还是植物体内磷浓度的变化，或是二者共同起作用尚不清楚。Liu等［14］通过番茄的分根试验发现，分根植株LePt1和LePt2基因的表达量介于所有根系磷胁迫和所有根系正常供磷的植株之间，认为植物对缺磷的响应可能是受植物整体磷状态影响的。关于高亲和磷转运蛋白基因表达水平与植物体内磷含量关系方面的研究，贾宏昉等［15］将水稻高亲和磷转运蛋白基因OsPT8转入烟草中，发现在低磷和正常供磷条件下，转基因烟草全磷含量和有效磷含量均显著高于野生型，认为烟草磷含量的提高是OsPT8基因与烟草PT1、PT2基因共同复杂作用的结果。目前关于磷胁迫对烤烟不同器官PT1、PT2基因表达的影响及其与磷素吸收利用的关系尚未见报道。本研究探讨了烤烟大田生育后期缺磷胁迫对其根系和叶片PT1、PT2基因表达及磷吸收的影响，以期从分子水平上阐明磷素对烤烟生长的生理效应，为进一步研究烤烟高亲和磷转运蛋白基因的作用机理、提高磷肥利用率提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

2014年在河南农业大学烟草科教园进行盆栽试验。供试烤烟品种为‘豫烟10号’，依据移栽后30d时该烤烟品种的整株生物量、整株磷积累量和根系表面积调查结果与相似处理条件下磷高效、对磷敏感的代表性烤烟品种（‘云烟85’、‘云烟2号’、‘K326’）同生育期的相关指标［16］对比认为，‘豫烟10号’属于磷高效对磷敏感的烤烟品种。土壤类型为褐土，基础肥力如下：有机质含量2.05%、碱解氮含量47.76mg·kg-1、速效磷（P）含量9.77mg· kg-1、速效钾（K）含量133.33mg·kg-1、pH 7.71。试验设不施磷（-P）和施磷（＋P）2个处理，其P2O5用量分别为每株0和7g（施磷处理的磷用量为豫中地区推荐的磷用量），N和K2O用量相同，分别为每株3.5和10.5g，采用分析纯硝酸铵、磷酸二氢钾和硫酸钾作氮、磷、钾肥源。以单株烟为单位，计算其肥料用量并提前分装，分装好的肥料直接与土壤充分混匀后装盆。

试验用盆钵高31.5cm，内口径42.0cm，底径28.5cm。取当地农田0～20cm耕作土，风干熏蒸消毒并过0.5cm×1.0cm网筛，与肥料混合均匀后装盆，每盆装土30kg。每个处理25盆，按120cm× 55cm的行株距盆栽，将盆身埋于土中，起到保水、降温的作用。烟株生长过程中经常转动盆体，避免根系扎入土中。5月4日移栽，7月6日左右打顶（因生长状况不同，不施磷处理烟株打顶时间稍晚于施磷处理）。采用滴灌装置浇水，根据天气情况和烟草不同生育期需水规律不同，适当延长或缩短灌水时间间隔。每次浇水时，于当天15：00打开滴灌装置，通过调节喷头旋钮来控制流速，以不成股流下为宜，21：00左右关闭装置，确保盆中土壤全部浸湿。其他栽培管理措施及病虫害防治均按照当地优质烟叶生产管理要求进行。

1.2 取样方法及测定指标

1.2.1 取样方法 在移栽后60、75和90d，各处理分别选取长势均匀一致的3株烟，在中部功能叶（自下而上第12片叶）6～10支脉之间快速剪取鲜烟叶适量，用锡箔纸和纱布包裹后迅速放到液氮中，带入实验室后置于-70℃冰箱保存。将每盆烟的地上部分砍去，用流水小心冲走盆里的土，直至烟根完全冲洗干净。剪取少量的鲜根，保存方法同上。所得的新鲜烟叶和根系样品用来测定高亲和磷转运蛋白基因的表达量。最后，将烟株分不同器官杀青（105℃，15min），65℃烘至恒重，并记录根系和叶片的干物质重；粉碎过60目筛，保存，用来测定根系和叶片的磷含量。

1.2.2 PT1和PT2基因的表达检测 采用试剂盒法提取烟叶和根系中的RNA（试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司），具体提取方法参看说明书，通过随机引物法反转录合成cDNA。采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法进行实时荧光定量PCR（qRTPCR试剂盒购于南京诺维赞生物科技有限公司），以检测烤烟不同器官PT1和PT2基因的表达水平。将反转录得到的cDNA稀释10倍后作为qRTPCR扩增模板。利用引物设计软件Primer Premier 5设计qRT-PCR检测所用的引物，内参基因L25和目的基因的引物序列如表1所示。

cDNA扩增反应在96孔PCR板中进行，反应体系为10μL，包含cDNA模板1μL，正反向引物（浓度为10μmol·L-1）各0.25μL，SYBR Green Master Mix 5μL，无菌水3.5μL。扩增反应程序为：95℃预变性10min，然后95℃变性10s，60℃退火30s进行40次循环反应。PCR扩增结束后进行融解曲线分析，以检验扩增的特异性。融解曲线程序为：95℃预变性15s；60℃变性15s；95℃退火15s。

表1 目的基因qRT－PCR引物序列Table 1 Primer sequences of target genes for quantitative real-time PCR

设定移栽后60d时不施磷处理（-P）叶片PT1和PT2基因表达量为1（对照），采用内均一化法计算其他时期目的基因的相对表达量，计算公式为：目的基因相对表达量＝2-△△Ct，其中Ct代表每个PCR反应管内荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，△Ct＝Ct目的基因-CtL25，△△Ct＝△Ct（样品）-

1.2.3 磷含量的测定 采用干灰化法处理烟叶和根系样品，使用ICP（电感耦合等离子体发射光谱仪，美国）测定磷含量。样品前处理的方法如下：准确称取0.4g（精确至0.000 1g）样品至坩埚中，加入3～4滴95%乙醇，将坩埚放于马福炉中，升温至100℃稳定0.5h，再升温至250℃稳定1h；最后升温至500℃稳定3h。冷却后取出，用5%硝酸（优级纯）洗涤过滤至50mL容量瓶中，定容，待进样。

1.3 数据处理

分别采用Excel 2003、SPSS 18.0绘制图表和对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 磷胁迫对烤烟不同器官高亲和磷转运蛋白基因表达的影响

2.1.1 PT1基因 由图1，A可知，随烟草生育期的推进，两处理叶片和根系PT1基因的相对表达量整体呈上升趋势，仅＋P处理叶片PT1基因表达量在移栽后75d时略有下降。不同器官间相比，叶片PT1基因的表达量高于根系，尤其是缺磷环境下，在移栽后60d时叶片PT1基因的表达量约是根系的7倍。磷胁迫促使根系和叶片中PT1基因的表达量上调，各生育时期-P处理叶片PT1基因相对表达量为1.00～1.50，＋P处理叶片PT1基因相对表达量为0.42～0.93；除移栽后60d时根系PT1基因相对表达量在两处理间差异不显著外，其他时期-P处理根系和叶片PT1基因的相对表达量均极显著地高于相应＋P处理（P＜0.01）。

2.1.2 PT2基因 qRT-PCR结果显示（图1，B），烤烟根系和叶片PT2基因的相对表达量均随生育期的推进逐渐增加，但叶片的增加趋势不明显。与PT1基因在器官中的相对表达水平不同，各生育时期PT2基因在叶片中的相对表达量为1.00～4.54，根系中高达4.90～61.86，即叶片远低于根系中PT2基因的表达水平。磷胁迫诱导PT2基因强烈表达，尤其在移栽后75d，-P处理根系PT2基因相对表达量约是＋P处理的4倍。方差分析结果表明，-P处理根系和叶片中PT2基因的相对表达量大多极显著高于相应＋P处理（P＜0.01），仅在移栽后90d时叶片PT2基因的相对表达量在处理间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 磷胁迫对烤烟不同器官磷素吸收利用的影响

2.2.1 器官磷含量 图2，A显示，随生育期的推进，烤烟叶片磷含量逐渐下降，且-P处理下降幅度较大；根系磷含量随生育期的推进无明显的变化规律。磷含量在不同器官间表现为叶片稍高于根系。不同处理间相比，＋P处理叶片的磷含量高于-P处理，但差异均不显著；根系磷含量在移栽后60和90d时＋P处理低于-P处理，且差异不显著，而在移栽后75d时，＋P处理烤烟根系磷含量为1.35 mg·g-1，并极显著高于-P处理（P＜0.01）。从图2，A还可以看出，根系磷含量的标准误差较大，进一步分析其变异系数也较大，表明所选样品的平均数未必能反映处理间的真实差异，这可能是根系磷含量随生育期无明显变化规律的原因，还有待进一步验证。

图1 不同磷水平下烤烟根系和叶片PT1、PT2基因的相对表达量相同生育期同一器官-P和＋P处理两两比较；＊和＊＊分别表示处理间差异达5%和1%显著水平；下同Fig.1 The expression of PT1and PT2gene in roots and leaves of flue-cured tobacco under different phosphorus levels The values of no phosphate fertilizer application（-P）was compared with that of recommended amount of phosphate fertilizer application（＋P）for the same organ and same growth stage，＊and＊＊denoted significant difference between two treatments at 5%and 1%probability levels，respectively；The same as below

图2 不同磷水平下烤烟根系和叶片的磷含量、磷积累量的变化Fig.2 The content and accumulation of phosphorus in roots and leaves of flue-cured tobacco under different phosphorus levels

2.2.2 器官磷积累量 由图2，B可知，烤烟不同器官的磷积累量随生育期的推进逐渐增加，移栽后75d时增加较快，移栽后90d时磷积累量的增长幅度较小。各生育时期＋P处理叶片和根系磷积累量分别为每株123～445和26～95mg，-P处理叶片和根系磷积累量分别为每株60～159和14～42 mg，叶片中磷素的积累量明显高于根系，＋P处理磷素的积累量又明显高于-P处理。进一步方差分析结果表明，在任何生育时期，烤烟叶片和根系磷积累量在处理间的差异均达极显著水平（P＜0.01）。

2.3 磷胁迫对烤烟不同器官干物质积累的影响

由图3可知，烤烟干物质重随生育期的推进逐渐增加，至移栽后90d，＋P处理烤烟根系和叶片干物质重分别为每株88和242g，-P处理烤烟根系和叶片干物质重仅为＋P处理根系和叶片干物质重的38%和43%，缺磷严重限制了烤烟根系和叶片的干物质积累。方差分析结果表明，在任何生育时期，-P处理烤烟根系和叶片的干物质重均极显著地低于＋P处理（P＜0.01），这种差异在生育后期更明显。

图3 不同磷水平下烤烟根系和叶片的干物质重Fig.3 The dry weight of roots and leaves of fluecured tobacco under different phosphorus levels

3 讨 论

关于烟草、辣椒和茄子等茄科作物在不同供磷水平下磷转运蛋白基因的表达情况，有研究认为磷胁迫促使茄科作物根系和叶片PT1基因的表达量显著增加，叶片中的相对表达量高于根系；PT2基因在植物根系中表达量极高，叶片中几乎不表达［17］。本研究中PT1和PT2基因的相对表达量在不同器官间的表现与上述研究结果一致。关于植物对营养元素的反应机制，一般认为有两种方式：一种是依赖于植物整体的营养状况引起的系统性调控，另一种则是根部对外界营养元素浓度变化发生的局部反应［18］。Chen等［17］对磷饥饿处理的植物恢复磷供应，一段时间后发现PT1基因仅在根系中有少量的表达，叶片中检测不到，而植物体内的磷含量显著增加，推测PT1基因的表达受植物组织内磷含量的调控，即上述的第一种调控方式。本研究结果中，＋P处理烟草根系和叶片中的磷素积累量显著高于-P处理，而PT1、PT2基因的相对表达量低于-P处理，推测本试验条件下PT1、PT2基因表达的调控信号来自于烟株本身磷营养状况的变化，尤其是叶片磷浓度的高低。

一般情况下，烟叶的磷含量（指浓度，而非积累量）随生育期的推进逐渐下降，至烟叶成熟时磷向种子和果实运输，烟叶磷含量进一步降低［1］，调制后烟叶的磷含量与烟草生长过程中烟叶磷含量的动态变化密切相关。国际优质烟叶磷含量为0.20%～0.28%，中国烟叶磷含量落在优质烟叶磷含量范围内的理论概率仅有59.8%［19］，如何提高烟草生长过程中对磷素的吸收利用效率进而提高烤烟磷含量，改善烟草的吸味品质［20］是一个值得探讨的问题。研究烤烟磷转运蛋白基因的功能及调控机制，利用分子生物技术结合常规育种手段选育对土壤非有效态磷利用能力强的烤烟新品种，是节约磷矿资源、改善低磷胁迫下烤烟磷素营养状况的有效途径［21］。本研究结果中，以移栽后90d为例，与正常供磷（＋P）相比，磷胁迫（-P）使烤烟叶片和根系PT1基因相对表达量分别上调62%和130%，叶片和根系PT2基因相对表达量分别上调38%和162%；同一生育时期-P处理叶片和根系的磷积累量、干物质重不到相应＋P处理叶片和根系磷积累量、干物质重的一半；叶片和根系的磷含量在处理间差异不显著。说明在缺磷胁迫下，相对于高亲和磷转运蛋白基因的表达量上调来说，有限的外源磷供给对烤烟磷素吸收利用的影响更大；＋P处理烟株的干物质重显著大于-P处理，表明缺磷胁迫对烤烟磷素吸收利用的影响是通过限制烤烟干物质积累来实现的。

烟草的吸磷能力是由土壤有效磷水平和自身的遗传因素共同决定的，不同烤烟品种的磷效率可能存在一定的差异，烟草高亲和磷转运蛋白基因在品种间的表达差异性还需要进一步研究，以筛选磷高效吸收基因和磷高效利用基因，从遗传育种角度寻找提高烟草磷效率的新途径。

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（编辑：裴阿卫）

Expression of High-affinity Phosphate Transporter Genes，Phosphorus Absorption and Utilization in Flue-cured Tobacco under Deficient Phosphorus Stress

WANG Yanli1，WANG Jing1，LIU Guoshun1，DING Songshuang1＊，LI Jianhua2
（1College of Tobacco Science，Henan Agricultural University／National Tobacco Cultivation ＆Physiology ＆Biochemistry Research Center，Zhengzhou 450002，China；2Xuchang Branch of Henan Tobacco Company，Xuchang，He’nan 461000，China）

In order to clarify the mechanism of deficient phosphorus stress on phosphorus absorption of fluecured tobacco，taking‘Yuyan No.10’as the material，we designed a pot experiment with two treatments，which were no phosphate fertilizer application and recommended amount of phosphate fertilizer.The expression differences of high-affinity phosphate transporter genes NtPht1；1（PT1）and NtPht1；2（PT2）between two treatments and the correlation of genes expression and phosphorus accumulation in leaves and roots at later growth stages were analyzed.The results showed that：（1）with the advancement of the growth stages，the relative expression of PT1and PT2genes，the dry matter weight and the phosphorus accumulation in leaves and roots of flue-cured tobacco increased gradually and the content of phosphorus in leaves decreased.Whereas，there was no significant pattern in roots.（2）The relative expression of PT1and PT2genes were up-regulated under deficient phosphorus stress.The relative expression of PT1gene inleaves was higher than that in roots，while PT2gene was the opposite，comparatively.（3）The accumulation of dry matter and phosphorus in flue-cured tobacco were limited under deficient phosphorus stress.At 90 days after transplanting，the dry matter weight and phosphorus accumulation in tobacco roots and leaves with no phosphate fertilizer application were less than half the values of the phosphorus application treatment.There were extremely significant differences among treatments at 0.01probability levels.This might imply that the up-regulated expression of PT1and PT2genes under deficient phosphorus stress was due to the decrease of phosphorus accumulation in tobacco tissues rather than the low available phosphorus soil.

flue-cured tobacco；deficient phosphorus stress；high-affinity phosphate transporter gene；phosphorus absorption and utilization

Q945.79；Q789

A

1000-4025（2015）07-1403-06

10.7606／j.issn.1000-4025.2015.07.1403

2015-04-02；修改稿收到日期：2015-05-08

中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项浓香型项目（Ts-01-2011005）

王艳丽（1989-），女，在读硕士研究生，主要从事烟草栽培生理生化研究。E-mail：yanliw000＠163.com

＊通信作者：丁松爽，博士，讲师，主要从事烟草生态学研究和教学工作。E-mail：shuangsd＠126.com