布鲁菌S2疫苗株的核酸探针检测方法的建立

张 岩，李 建，宫利娜，高航飞，李旭东，安维雪，申之义

（内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特010018）

布鲁菌病（Brucellosis）是一种全世界广泛分布的人兽共患慢性传染病，布鲁菌病流行范围广，不易根除，不仅给畜牧业造成巨大的经济损失，还严重威胁着人类和动物的健康［1］。控制布鲁菌病传播的最有效手段是疫苗免疫接种，而目前预防布鲁菌病的最好疫苗是减毒活疫苗［2］，主要有 S2、M5、S19、Rev.1等，我国主要使用S2疫苗。目前，布鲁菌的检测主要依靠细菌学和免疫学检验技术，细菌培养虽然可以直接观察到布鲁菌，得出确定的诊断结论；但布鲁菌的培养通常需要3d～7d时间，操作具有一定的危险性，并且阳性率偏低，需要专业的技术人员进行操作［3］；免疫学技术是动物布鲁菌检测的常规方法，具有快速、简便、费用低等优点，但也存在不足，如检测依赖于动物体内抗体水平会因为抗体交叉反应而出现假阳性，血清学阳性只能推断感染，却不能确定感染状态是持续感染还是耐过状态［4］。

PCR方法无需高级别防护要求，具有快速、特异、灵敏等优点，已成为目前较为重要的布鲁菌检测手段。虽然布鲁菌基因片段在种属之间具有较高的同源性［5］，易出现特异性不佳、假阳性等情况［6］，但仍然可以区分布鲁菌属及大部分种［7-9］，甚至区分S19疫苗株和野毒株［10］，只是目前尚无实用的PCR方法能鉴别出S2疫苗株。实时荧光定量PCR（realtime PCR）是近年来发展起来的分子生物学技术，突出特点是快速、无需电泳并能避免污染，但是realtime PCR成本高，限制了其应用范围和普遍适用性［11］。为了鉴别出疫苗免疫和布鲁菌感染，通过查阅文献和对NCBI公布的布鲁菌毒株基因序列比对，发现只有S2疫苗株在IclR基因存在25bp的缺失，根据缺失部分设计核酸探针，用以检测S2疫苗株，新的诊断方法对布鲁菌病的预防和控制有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 布鲁菌S2疫苗株由金宇保灵生物公司提供；布鲁菌M5株、M28株、16M株、猪1330株、牛544A株由中国动物卫生与流行病学中心提供；流产沙门菌、多杀性巴氏杆菌、葡萄球菌、大肠埃希菌、牛支原体由内蒙古农业大学传染病实验室和微生物实验室提供。

1.1.2 主要仪器与试剂 PCR仪（eppendorf AG 22331Hamburg Garrmany）为 Eppendorf产品；水浴锅（HW.SY11-K）为北京市长风仪器仪表公司产品；凝胶成像仪（SYDR412391）为 Gene Campany Limited GBOX HR made in the VK 产品 ；DNA 提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞均购自北京天根生化科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix、pMD19-T 连接试剂盒、DNA Marker 500为 TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒为美国AXYGEN公司产品；Gene JET Gel Extraction Kit为宝生物工程（大连）有限公司产品；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ为Roche公司产品；其他试剂为实验室分析纯；耗材为内蒙古农业大学传染病实验室提供。

1.1.3 引物设计与合成 参照NCBI公布的Brucella suis bv.1str.S2chromosome1全序列（CP 006961.1），利用 Oligo6.0软件设计一对引物和一条探针，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。上 游 引物：5′-ATGAAGGGCGTGGCGAAGGA-3′下 游 引 物：5′-AAGGCGATTTGCGGGTGG-3′S2 探 针：5′-CAGTTTCCAAGGTCGGCTACGAACAGCGT-3′。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取 试验菌种复苏后，各挑取单个菌落到1.5mL适宜液体培养基中，37℃培养至对数生长中期，80℃水浴锅灭活1h，然后按细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取各细菌基因组DNA，经初步定量的核酸置-20℃保存备用。

1.2.2 PCR方法的建立 25μL的反应体系中，8.5μL去离子水，稀释好的上、下游引物各1μL，模板2μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5μL；PCR反应程序为：94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。扩增产物用30g／L琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，然后用Gene JET Gel Extraction Kit试剂盒胶回收目的片段，定量后置-20℃保存。

1.2.3 PCR产物鉴定 S2疫苗株PCR扩增的特异性条带胶回收后，按常规方法克隆进pMD19-T载体，送华大基因公司进行测序。

1.2.4 探针特异性检测 杂交过程按罗氏DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅡ试剂盒说明书进行：分别将纯化的布鲁菌S2株、M5株、M28株、16M 株、猪1330株和牛544A的PCR扩增的回收产物于沸水中变性10min后迅速置冰水浴冷却10min；取变性样品2μL，点于处理好的NC膜上120℃烘烤固定30min；预杂交30min后42℃杂交液（地高辛探针25ng／mL）中杂交4h。杂交完成后，首先以2×SSC（含1g／L SDS，W／V）25℃晃动洗涤2次，每次5min；再以0.5×SSC（含1g／L SDS，W／V）51℃洗涤2次，每次15min；洗涤后的NC膜置100mL封闭液中，25℃封闭30min；然后置于抗DIG抗体液（1∶5 000）中25℃孵育30min，接着用洗涤缓冲液洗涤两次，每次15min；以检测缓冲液室温平衡5min，置于20mL底物显色液中，避光显色1h；最后以适量灭菌双蒸水洗涤5min终止反应，观察结果并照相（重复3次）。

1.2.5 探针敏感性检测 将变性的胶回收产物稀释为25、1ng／μL、100、10、1、0.1pg／μL及阴性对照，分别取2μL点于处理好的NC膜上，按1.2.4步骤进行斑点杂交和显色，观察结果并照相（重复3次）。

1.2.6 病料中S2疫苗的检测 从某免疫过S2疫苗的牛场随机采取10份血样，提取DNA进行PCR扩增，并应用建立的布鲁氏菌S2疫苗株的斑点杂交检测方法进行检测。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取试验菌株基因组DNA为模板，使用自主设计的引物进行常规PCR扩增。取常规PCR扩增产物10μL，在30g／L琼脂糖凝胶点样进行电泳，采用紫外凝胶成像仪观察结果，按照25μL反应体系和PCR循环程序，在退火温度为56℃时，选取的布鲁菌株都能获得预期的PCR条带。M5、M28、16M、猪1330、牛544A株均能扩增出约360bp左右的条带；S2疫苗株扩增出约330bp的条带；流产沙门菌、多杀性巴杆菌、葡萄球菌、大肠埃希菌、牛支原体均没有任何可见条带。PCR产物电泳结果见图1。

图1 布鲁菌PCR扩增结果Fig.1 PCR results of Brucellastrains

2.2 PCR产物鉴定结果

S2疫苗株PCR扩增的特异性条带胶回收后，按常规方法克隆进pMD19-T载体，阳性菌株送华大基因公司进行测序。将测序获得的基因序列使用DNA Star软件中的MegAlign进行拼接，然后登陆NCBI，使用Blast进行比对，S2疫苗株PCR产物的测序结果与Brucellasuisbv.1str.S2chromosome1，complete sequence（Sequence ID：gb｜CP 006961.1｜246683-247016）序列一致，说明扩增的片段正确。

2.3 探针特异性检测结果

经过42℃杂交液杂交4h及免疫显色反应后，杂交膜上仅阳性对照和S2疫苗株出现斑点，其他菌株未出现斑点（3次重复结果一致），结果见图2，因此该探针具有特异性。

图2 探针特异性结果Fig.2 The results of probe specificity

2.4 探针敏感性检测结果

经过42℃杂交液杂交4h及免疫显色反应后，结果显示，25、1ng／μL、100、10pg／μL均能显色，且斑点颜色随着浓度的递减而变淡，而1、0.1pg／μL、阴性对照未显色（3次重复结果一致），结果见图3，因此该探针最低检测量为10pg／μL。

图3 探针敏感性结果Fig.3 The results of probe sensitively

2.5 病料中S2疫苗的检测结果

提取的样本DNA用自主设计的引物进行常规PCR扩增，结果显示10个样本有6个能扩增出约330bp的片段，其他4个没有片段（图4）。PCR扩增出的片段经过回收、变性、烘烤固定，然后进行斑点杂交和免疫显色，结果全部出现斑点（图5），说明扩增的PCR产物为S2疫苗株基因序列。

图4 样本PCR检测结果Fig.4 PCR results of samples

图5 斑点杂交结果Fig.5 The results of dot blot hybridization

3 讨论

布鲁菌作为目前全世界反弹最为严重的重要人畜共患病病原，已经成为相关学科研究的热点。近10年来，布鲁菌病在中国流行情况越来越严重，畜群和人群中布病感染率逐年上升，再次严重地威胁着畜牧业和公共卫生［12］。目前布鲁菌病的诊断方法有多种，以病原学和免疫学为主［13］，但是这些方法大多不完善，而且没有快速、准确、易操作的检测方法能鉴别出疫苗免疫和自然菌株感染，鉴于布鲁菌病对公共卫生和经济发展的严重影响，全球各国对净化、根除布病的要求也愈来愈迫切 。通过查阅文献和对NCBI发表的布鲁菌株基因序列比对，发现S2疫苗株在IclR基因存在25bp（SequenceID：gb｜CP006961.1｜：246968-246969）的缺失，而其他菌株没有缺失，根据缺失部分，设计了长度为29bp的探针，针对该探针位点，设计PCR引物，扩增出的基因包含探针，这样就将PCR的敏感结合进来，使该诊断方法具有高特异性，高敏感性。

本试验建立了相对完善的布鲁菌斑点杂交鉴别方法，能准确的鉴别出布鲁菌S2疫苗株，具有重要的生产实际意义。斑点杂交方便快捷，膜制备时间短，并且可以大量制备后置于4℃保存半年之久，探针可以重复利用，从病料中提取DNA开始，经过一次PCR扩增和一次杂交就能准确快速进行诊断，鉴定过程不超过10h，既可以确定是否是布鲁菌属，又可以区分S2疫苗株和其他菌株。本研究建立的核酸探针检测方法充分利用了PCR的高灵敏度和斑点杂交的高特异性，不仅为布鲁菌病的防控及生物安全提供了快速、安全、便捷的技术支持，也可作为布鲁菌病临床诊断的辅助手段。

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