MiR-106b对食管癌KYSE150细胞的生长及细胞上皮间质转化的影响

戴 芳， 刘 涛， 郑树涛， 刘 清， 王 栋， 伊力亚尔·夏合丁， 卢晓梅

(1新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院， 2新疆维吾尔自治区食管癌研究所， 乌鲁木齐 830054)

MiR-106b对食管癌KYSE150细胞的生长及细胞上皮间质转化的影响

戴 芳1， 刘 涛1， 郑树涛1， 刘 清1， 王 栋1， 伊力亚尔·夏合丁2， 卢晓梅2

(1新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院，2新疆维吾尔自治区食管癌研究所， 乌鲁木齐 830054)

目的 研究微小RNA106b(miR-106b)对食管癌KYSE150细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的影响，为临床治疗食管癌提供新的理论依据。方法 用miR-106b慢病毒转染KYSE150细胞，实验分为3组：control组 (未转染miR-106b的KYSE150细胞)、miR-NC组(转染随机序列)和miR-106b组 (转染miR-106b的KYSE150的细胞)。采用实时荧光定量聚合酶联反应(qRT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测miR-106b和EMT的相关标记物E-钙黏蛋白(E-Cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-Cadherin)的表达情况， 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞的增殖能力，划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell方法检测细胞的侵袭能力。结果 慢病毒稳定转染miR-106b后，食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力均增强(P<0.05)；qRT-PCR与Westernblot检测显示miR-106b组E-Cadherin表达较miR-NC组、control组明显降低(P<0.05)；N-Cadherin表达明显升高(P<0.05)。结论miR-106b能够促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，同时能促进上皮间质的转化。

miR-106b； 细胞增殖； 细胞迁移； 细胞侵袭； 上皮间质转化

食管癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一。目前手术是治疗食管癌最有效的方法，但晚期食管鳞癌5年生存率仍低于15%[1]，淋巴结转移依然是预后不良的因素[2]。因此，分子病理学研究对食管癌的发生、发展及转移起着关键性的作用。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA分子，其长度约22个核苷酸，参与转录后水平mRNA的降解或翻译抑制来调控基因表达,在肿瘤的形成中具有重要作用[3]。微小RNA106b(miR-106b)基因是miR-106b-25家族中的一员。多数研究表明，miR-106b-25基因簇的3个成员在肿瘤中同时存在是相当少的，大部分只是其中1个或2个成员高表达。而miR-106b经常作为致癌因素的miRNA分子，在喉癌[4]、胃癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]等多种肿瘤组织中高表达，具有调控肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖等重要的功能。近年来研究发现，高表达的miR-106b促进了肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)的发生，即肿瘤细胞由上皮表型向间质表型发展，参与了肿瘤的侵袭和转移[8]。本课题组通过微阵列法发现Has-miR-106b在食管癌组织中明显表达上调，本研究在此基础上，在细胞水平及分子水平上进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料食管鳞癌细胞株KYSE150由中国医学科学院国家重点实验室赠送，RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，二甲基亚枫DMSO(美国Invitrogen公司)，慢病毒LV-hsa-mir-106b(14968-1)和阴性对照病毒CON238(上海吉凯公司)，RNA反转录试剂盒(美国Thermo公司)，荧光定量PCR试剂盒(日本Takara公司)，RIPA裂解液、BCA试剂盒(美国Thermo公司)，EMT抗体试剂盒(美国Cell Signaling公司)，内参抗体(美国Abcam公司)，Western blot二抗试剂盒(美国Invitrogen公司)，PVDF膜(美国Thermo公司)，四甲基偶氮唑盐MTT(美国Invitrogen公司)，Transwell 小室(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染和分选 食管鳞癌细胞株KYSE150用含有10%胎牛血清的1640培养液，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。实验分为3组：control组 (未转染miR-106b的KYSE150细胞)、miR-NC组(转染随机序列)和miR-106b组 (转染miR-106b的KYSE150的细胞)，用慢病毒试剂进行转染.。将细胞按约3×105个/孔的密度接种于6孔板中，第2天待细胞生长达70%～80%时，按说明书进行慢病毒转染，8～12 h后弃去含有病毒的旧培养液，换含10%胎牛血清的1640培养液，在37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养48 h。 每组设3个复孔。 转染48 h后，正常程序消化细胞并收集至15 mL离心管中，各组做好标记，1 000 r/min离心5 min,后用无血清的1640培养液每管500 μL重悬，置于冰上，用流式细胞仪筛选带有GFP标记的转染细胞。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞的 mRNA 的相对表达量 收获各组细胞，按照 Trizol 试剂盒说明书提取总 RNA。按照PCR反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录成cDNA。PCR反应体系包括TAKARA通用荧光染料SYBR Premix Ex TaqTM10 μL、miRNA上游及下游引物各1 μL 10 μM 、 cDNA产物2 μL、无核酸酶水6 μL，共20 μL。将PCR总反应体系混匀，离心。每孔为20 μL PCR反应体系，每组设3个复孔，离心。采用三步法，反应条件：起始激活95℃反应3 min；PCR循环50次，95℃反应10 s，58℃反应30 s； PCR再进行81个循环，58℃反应10 s。结果采用2-ΔΔCt法进行分析。引物由上海生工公司设计合成(表1)。

表1 反转录及qRT-PCR所用引物序列表

1.2.3 Western blot实验 收获各组细胞，用RIPA裂解液裂解并提取细胞总蛋白，BCA试剂盒定量检测蛋白浓度，将蛋白样品和4×蛋白上样缓冲液按3∶1的比例混匀、离心，置于PCR仪中使蛋白变性，100℃ 10 min。以每孔上样量为50 μg，制备10%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温封闭1 h，分别加入1∶1 000稀释的兔抗人的E-Cadherin抗体、N-Cadherin抗体和GAPDH抗体，于4℃孵育过夜，之后用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸馏水洗膜1次，每次5 min；加入人抗兔二抗室温孵育1.5 h，用PBS-Tween20洗膜3次，每次5 min，蒸馏水洗膜1次，每次5 min；加入显影液显色，显出紫色条带后，用蒸馏水终止显色，在成像分析系统上成像并进行密度分析。以GAPDH为内参，计算各组蛋白的相对表达量。

1.2.4 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法) 正常消化呈对数生长期细胞，96孔板按3×103个/孔接种细胞，每组设4个复孔，每孔体积为200 μL。分别于转染前及转染后24、48、72、96、120 h时，将事先配好的MTT溶液按20 μL/孔加入，37℃、 5% CO2恒温培养箱孵育4 h后弃去上清液，每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)15 μL，摇床上摇10 min，使之充分溶解，见紫色结晶物出现，用酶标仪检测各组细胞，在波长为490 nm处测定各孔吸光度值，记录结果并绘制生长曲线。

1.2.5 细胞划痕实验 正常消化呈对数生长期细胞，6孔板按5×105个/孔接种细胞，当细胞生长面积达80%时，用10 μL无菌枪头划痕，每孔均匀划3条线，再用PBS润洗2遍，弃之，分别于转染前及转染后24、48 h时在倒置显微镜下观察划痕愈合速度并拍照。

1.2.6 细胞侵袭实验 正常消化呈对数生长期细胞，Transwell小室按3×105个/孔接种细胞，用无血清的1640培养液200 μL重悬，下室为10% FBS 1640培养液500 μL，每组设3个复孔。分别于48 h后，将Transwell小室用无菌PBS洗2遍，甲醇固定30 min，PBS再次洗2遍，结晶紫染色30 min后用PBS洗2遍，干燥，在倒置显微镜下选取5个视野拍照并计数。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测慢病毒转染KYSE 150细胞后miR-106b的mRNA的表达变化control组和miR-NC组较miR-106b组的mRNA表达水平明显增高(P<0.05)(图1)。

2.2 miR-106b基因过表达后对KYSE150细胞增殖影响慢病毒转染miR-106b基因后， 0 h和24 h时各组490 nm波长处吸光度值差异无统计学意义(P>0.05)，48、72、96、120h时miR-106b组吸光度值明显高于control组和miR-NC组(P<0.05)(图2)。

与control组比较，*P<0.05； 与miR-NC组比较，△P<0.05。

图1 qRT-PCR检测慢病毒转染KYSE 150细胞后miR-106b mRNA相对表达量

与control组比较，*P<0.05； 与miR-NC组比较，△P<0.05。

图2 MTT检测miR-106b转染KYSE150后细胞增殖能力变化

2.3 miR-106b基因过表达后对KYSE150细胞迁移能力的影响慢病毒转染miR-106b基因后， 与control组和miR-NC组比较，miR-106b组的迁移能力明显更强并基本愈合，差异均有统计学意义(P<0.05)，而control组与miR-NC组迁移能力比较差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

2.4 miR-106b基因过表达后对KYSE150细胞侵袭能力的影响慢病毒转染miR-106b基因后，与control组和miR-NC组比较，miR-106b组的侵袭能力明显更强(P<0.05)(图4)。

2.5 miR-106b基因过表达后对EMT的影响

2.5.1 miR-106b基因过表达后E-Cadherin和N-Cadherin的 mRNA的表达变化 与control组和miR-NC 组比较， miR-106b组E-Cadherin的mRNA表达水平下降(P<0.05)， N-Cadherin的 mRNA 表达水平升高(P<0.05) (图5)。

2.5.2miR-106b基因过表达后E-Cadherin和N-Cadherin的蛋白的表达变化Westernblot检测结果显示,E-Cadherin蛋白条带在135kDa处显色，N-Cadherin蛋白条带在140kDa处显色，GAPDH蛋白条带在37kDa处显色。miR-106b组E-Cadherin蛋白的相对表达量明显低于control组及miR-NC组细胞蛋白的相对表达量,差异有统计学意义(P<0.05)；miR-106b组N-Cadherin蛋白的相对表达量显著高于control组和miR-NC组细胞蛋白的相对表达量,差异具有统计学意义(P<0.05)(图6)。

a: 划痕细胞图

b: 柱状图

与control组比较，*P<0.05； 与miR-NC组比较，△P<0.05。

图3 细胞划痕实验检测miR-106b转染KYSE150后细胞迁移能力变化(放大倍数×100)

a: 侵袭细胞图

b: 柱状图

与control组比较，*P<0.05； 与miR-NC组比较，△P<0.05。

图4 细胞侵袭实验检测miR-106b转染KYSE150后细胞侵袭能力变化(放大倍数×100)

a: E-Cadherin的mRNA的相对表达量 b: N-Cadherin的mRNA相对表达量

与control组比较，*P<0.05； 与miR-NC组比较，△P<0.05。

图5 qRT-PCR检测慢病毒转染KYSE 150细胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相对表达量

图6 Western blot 检测慢病毒转染KYSE 150细胞后E-Cadherin和N-Cadherin mRNA相对蛋白表达

3 讨论

MiR-106b定位于人类染色体7q22，属于miR-106b-25基因簇的一员，通过大量的研究表明,miR-106b在肿瘤中被视为癌基因,是与肿瘤生长、细胞生存和血管形成相关的miRNA[9]。

已经有大量研究证实，miR-106b参与了多种重要的信号通路。在转化生长(TGF-β)因子信号通路中，可以通过调控p21[10]或EMT相关信号通路[8]促使肿瘤细胞逃避TGF-β诱导的生长抑制作用，参与了肿瘤细胞的迁移、侵袭、凋亡、周期和增殖等生物进程[11]。miR-106b基因也是insulin/IGF通路的一部分，通过下调PTEN的表达，影响细胞周期和肿瘤细胞微环境[12]。也可通过调控RB基因来参与细胞周期进程[13]。多项研究报道，miR-106b在肝癌细胞中促进了细胞的迁移和侵袭[10]。在胃癌细胞中，miR-106b通过调控靶基因PTEN来促进细胞的迁移和浸润[5]。

目前，miR-106b在食管癌方面的表达及功能研究报道比较少。研究发现miRNAs的异常表达可以明显影响食管癌的进程[14]。Kan等[15]用基因芯片和qRT-PCR方法分析食管细胞(HEEpiC、QhTRT、ChTRT、GihTRT和OE-33)和食管组织(正常上皮组织、Barrett食管组织和食管腺癌组织)，结果发现在肿瘤发生的不同阶段，随着miR-106b基因的扩增，miR-106b的表达量也升高，在细胞功能实验和动物实验中显示miR-106b具有促增殖、抗凋亡和细胞周期促进作用。本研究显示,与对照组相比，高表达miR-106b的KYSE150细胞促进了细胞的增殖、迁移和侵袭。进一步检测发现，过表达miR-106b的KYSE150细胞、上皮表型E-Cadherin的表达明显降低，间质表型N-Cadherin明显升高，促进了EMT的发生。而高表达的miR-106b可能通过TGF-β信号通路实现其功能。通常肿瘤细胞会逃避抑瘤作用，将TGF-β信号转换成促进信号，通过该信号诱导维持上皮间质转化(EMT)、促进肿瘤细胞的侵袭和转移等[16]。Smith等[17]对乳腺癌的研究发现，miR-106b可以靶向Smad7来激活TGF-β信号通路和促进EMT的发生。最近，Zhou等[6]研究表明，miR-106b可以通过E-Cadherin介导激活蛋白EP300来调控EMT的发生，使乳腺癌细胞产生对阿霉素的耐药性。Yau等[10]对肝癌细胞的研究证实，过表达miR-106b可以激活EMT，增加肝癌细胞的运动和侵袭能力。然而，也有研究显示高表达 miR-106b对子宫内膜癌起抑制转移的作用[18]。可见，miR-106b在不同类型的肿瘤中拥有反应癌基因或抑制癌基因的功能。

综上所述，miR-106b具有促进癌细胞生长的作用，且miR-106b可能通过EMT来促进食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，但这还需要进一步研究证实。本研究结果可为食管癌的预防诊断及治疗提供新的理论依据。

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(本文编辑 杨晨晨)

MicroRNA-106b promotes proliferation of esophageal cancer cell and Epithelial-Mesenchymal Transition process

DAI Fang1, LIU Tao1, ZHENG Shutao1, LIU Qing1, WANG Dong1, Ilyar Sheyhidin2, LU Xiaomei2

(1ClinicalMedicalResearchInstitute,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,2EsophagealCancerResearchInstituteofXinjiangUygurAutonomousRegin,Urumqi830054,China)

Objective To investigate the effects of miR-106b in the esophageal cancer cell proliferation, migration, invasion. Methods Based on KYSE150 cell transfected with miR-106b, the expression of miR-106b and EMT-associated markers were detected by quantitative RT-PCR(qRT-PCR). EMT-associated proteins were measured by western blot and cell proliferation was detected by using MTT assay. In addition, cell migration and invasion ability were evaluated by wound healing assay and transwell assay. Results The results showed that the cell proliferation, migration and invasion was significantly increased in esophageal cancer KYSE150 (P<0.05)aftertransfectedwithmiR-106b.Furthermore,expressionofE-CadherinwassignificantlylowerinthegroupoftransfectedwithmiR-106bthanthecontrolgroup(P<0.05).Meanwhile,expressionofN-Cadherinwashigher(P<0.05). Conclusion The present data revealed that miR-106b could promote the cell proliferation and has potential in effect on EMT process in esophageal cancer.Keywords: miR-106b; cell proliferation; cell migration; cell invation; epithelial-mesenchymal transition (EMT)

国家自然科学基金(81160303，81260359、U1303321);新疆维吾尔自治区重大科技专项计划(201430123-1)

戴 芳(1987-)，女，在读硕士，研究方向：肿瘤分子病理学。

卢晓梅，女，博士，教授，研究员，博士生导师，研究方向：消化道肿瘤的转化医学研究，E-mail：luxiaomei88@163.com。

R34;R

A

1009-5551(2015)12-1466-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.002

2015-08-30]