Rh部分D基因型分析

何路军 乔芳 石翠英 王振雷 赵志弘 刘敬闪 张虹 田亚娟

·论著·

Rh部分D基因型分析

何路军 乔芳 石翠英 王振雷 赵志弘 刘敬闪 张虹 田亚娟

目的研究7例Rh部分D样本的基因分型。方法采用PCR-SSP技术检测常规血清学试验为D变异型的样本中的Rh部分D进行D基因分型。结果在30例常规血清学试验中，23例具有完整的RHD基因外显子(Rh弱D型)，7例部分外显子缺失，为Rh部分D，23例为弱D型，并对部分D样本进行了基因分型，4例检测为D Cat.ⅥⅢ，1例为D Cat.Ⅵtype2，1例为D Cat.Ⅵtype 1，1例为基因2.9外显子融合，表示为RHD-CE(2-9)-D。结论Rh部分D型与弱D型在血清学试验中无法区分，采用分子生物学方法才能够更准确的分型，更能确保输血安全。

Rh阴性;Rh部分D;弱D;基因型

Rh血型在临床输血中具有重要意义，也是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统。Rh抗原是由位于人类染色体lp34.3～36.1区域上的2个同源及紧密连锁的基因所编码，即RHD和RhCE基因，每个基因都是由10个外显子组成;RH基因编码的抗原多肽，分为胞外区、跨膜区和胞内区，贯穿红细胞膜12次，有12个跨膜结构域，细胞外形成6个环，Rh的抗原决定簇就位于这6个环上［1］。D抗原抗体与输血的关系仅次于ABO血型，50%～75%Rh(D)阴性人接受Rh(D)阳性的血可能产生抗-D，导致免疫性输血反应［2］。为了减少输血反应，正确检定Rh(D)阴性个体显得非常重要。D抗原存在多种变异体，如部分D、弱D、D放散型等。D抗原的分布与表达强弱不一，RhD常规定型技术无法鉴定，而分子生物学方法对于探讨其分子背景更为有利。

1 材料与方法

1.1 材料30例受检样本均来源于河北省血液中心的非亲缘无偿献血者，经常规血清学技术检测为RhD变异型。

1.2 方法

1.2.1 试剂:Rh定型常规血清学检查参照《中国输血技术操作规程》［3］。3批抗-D血清来源:上海血液生物医药有限公司、德国BIOTEST公司、美国IMMUCOR公司。将初筛RhD阴性者的红细胞与单克隆抗D (IgM+IgG)及不完全抗D血清(IgG)做AHG，设阴性及阳性对照。抗D血清100 μl及2%～5%被检红细胞50 μl加入试管中，37℃孵育30 min，三洗后分别加入IgG 100 μl，混匀后3 000 r/min，离心15 s，观察结果。与任意抗D全部凝集或部分凝集者判定为D变异型，并重复试验验证。

1.2.2 DNA提取:严格按照TIANGEN血液基因组DNA纯化试剂盒说明书操作，提取基因组DNA，紫外分光光度计检测OD260/OD280以确定DNA浓度及纯度。置于-20℃保存。

1.2.3 序列特异性引物PCR(sequence specific p～imers，SSP)根据RHD基因PCR引物体系(由上海生工公司合成)，以HGH(human growth hormone，HGH)为内对照，对RHD基因第3、4、5、6、7、9特异性外显子进行等位基因特异性PCR扩增。

1.2.4 基因检测:采用天津市秀鹏生物技术开发有限公司研制的《人类红细胞RHD血型部分D基因检测试剂盒》对该7例样本进行分析。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照观察结果。

2 结果

2.1 30例经血清学试验确认为RhD变异型的样本中，23例具有完整的RHD基因外显子即为Rh弱D型，7例部分外显子缺失，为Rh部分D。见图1。

2.2 7例部分D中，4例样本检测为D Cat.VI III，1例样本检测为D Cat.VI type2，1例样本检测为D Cat. VI type1，1例检测为RHD基因2～9外显子融合，表示为RHD-CE(2-9)-D。见图2。

图1 RHD特异性外显子检测电泳图(弱D与部分D)

图2 部分D基因检测电泳图

3 讨论

在红细胞30个血型系统中，Rh血型系统是最具复杂性和多态性的血型系统，近年来，随着编码Rh蛋白的基因被克隆、测序和越来越多的深入研究，Rh抗原的一些分子机制也逐步被发现。RhD抗原分为D阳性、D阴性和D变异型，而Rh(D)变异型包括盐水法阴性、只能通过IAT试验检测到D抗原的弱D变异型和部分D变异型，以及只有吸收放散试验阳性的DEL变异型;弱D抗原的改变位于细胞膜内和膜中，细胞膜外的蛋白质没有改变，只有抗原数量的改变而抗原性质未改变;部分D抗原的改变则位于细胞膜外，抗原性和数量都发生了改变［4］。部分D和弱D具有不同的分子遗传机制，形成弱D的氨基酸替换主要位于胞浆内和跨膜区域，表现为抗原位点数目减少，但抗原表位数目基本不变;而部分D的分子形成机制有3类，分别是RHD/CE融合等位基因(hybrid allels)、细胞外环的错义突变和散在的错义突变［4］。形成部分D(partial D)的氨基酸变异主要位于胞外区域，表现为缺失一个或多个抗原表位，因此部分D更易产生抗体。多数部分D是由于RHD基因一部分被相应RHCE基因部分替换形成的RHD/CE融合等位基因，这种D变异体称为D类别(D category)。目前国际上经RHD全基因序列分析鉴定和Genebank登录的部分D已发现6个类别，用DI～DVI表示。我们在之前的研究中已发现两种D类别，即DBT-1和RHD-CE(4-9)-D［5］，在后续的部分D样本基因型的检测中，我们又发现了D Cat.VIⅢ、D Cat.VI type1、D Cat.VI type2和RHD-CE(2-9)-D四种基因型。随着研究样本数量的增加，我们会发现越来越多的部分D的基因型及分子背景，对于安全输血和遗传学的研究都具有重要的价值。

部分D的氨基酸改变主要位于胞外环，引起红细胞膜上Rh(D)抗原缺乏某些表位，血清学特征为表达不完整的D抗原，若受到D阳性细胞(或携带部分D所缺失的表位D细胞)刺激，会产生针对缺失表位的抗体。若部分D作为供血者输给Rh(D)阴性受血者，会产生针对其携带表位的抗体，引起溶血反应。弱D表型的患者输入Rh(D)阳性红细胞时一般不会产生抗-D［6］。国内有报道部分DVI type3型个体产生抗体［7］。而弱D和部分D血清学手段无法区分和鉴定，只有通过分子生物学检测予以鉴别。因此，准确鉴定部分D和弱D对于指导临床输血和节约Rh阴性血库存，更有效的利用稀有血型资源具有重要的意义。

1Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system:a review.Blood，2000，95:375-387.

2林甲进，朱碎永，白植地.Rh弱D，Del的检测及意义.温州医学院学报，2008，38:361-362.

3李勇，杨贵贞主编.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.第1版.北京:中国科学技术出版社，1999.70.

4Flegel WA，Wagner FF.Molecular biology of partial D and weak D:implications for blood bank practice.Clin Lab，2002，48:53-59.

5乔芳，石翠英，何路军，等.4例Rh部分D基因型研究.河北医药，2011，33:769-770.

6Wagner FF，Frohmajer GF，Ladewig B，et al.Weak D alleles express distinct phenotypes.Blood，2000，95:2699-2708.

7左宏莉，何智，罗广平，等.RhD VI III表型分子生物学研究及其临床意义.中国输血杂志，2008，21:174-176.

Analysis for partial RhD genotype

HE Lujun，QIAO Fang，SHI Cuiying，et al．Hebei Provincial Blood Center，Shijiazhuang

050071，China

ObjectiveTo investigate genotyping of 7 cases of partial RhD specimens.MethodsThe genetyping technique(PCR-SSP)was performed for partial RhD variants identified by common serological tests.ResultsAmong 30 specimens identified as D variants during routine serological experiment，7 specimens were defined as partial RhD and 23 specimens as weak D.Then 7 specimens of partial RhD were genetyped further in which 4 cases were D Cat.ⅥⅢ，1 case was D Cat.Ⅵtype 2，1cases was D Cat.Ⅵtype 1 and 1 case was RHD-CE(2-9)-D.ConclusionThe routine serological experiments can not differentiate partial D from weak D，however，the molecular biological methods can type accurately in order to ensure the safety of blood transfusion.

Rh negative;partial RhD;weak D;genotype

R 349.6

A

1002-7386(2015)02-0179-03

2013-12-06)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．005

项目来源:河北省科学技术研究与发展计划(编号:09276102D-40)

050071石家庄市，河北省血液中心