多药耐药相关蛋白在乳腺癌患者外周血单个核细胞中的表达研究

李易明 刘宇琨 刘竞 刘钊 高璇 王宏 李文建

·论著·

多药耐药相关蛋白在乳腺癌患者外周血单个核细胞中的表达研究

李易明 刘宇琨 刘竞 刘钊 高璇 王宏 李文建

目的检测健康人和乳腺癌患者外周血单个核细胞中多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)基因的表达水平，探讨MRP在乳腺癌患者中的可能作用。方法抽取20例健康人和50例乳腺癌患者外周血，运用ELISA法检测2组实验对象血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素6(IL-6)细胞因子的含量;提取外周血中单个核细胞(Peripheral blood monouclear cells，PBMCs)，后用荧光实时定量PCR和Western blot技术检测BCRP和MRP2/3/4/5 mRNA和相应蛋白表达情况。结果ELISA法检测乳腺癌患者外周血血清中TNF-α、IL-8、IL-6细胞因子的含量明显高于健康人对照组(P＜0.05);荧光实时定量PCR检测BCRP和MRP5的mRNA表达水平高于健康人对照组(P＜0.05)，其余MRP没有显著性差别(P＞0.05);Western blot检测蛋白表达与mRNA结果一致。结论乳腺癌患者外周血中的促炎因子含量的升高与BCRP和MRP5的表达调控有一定关系，具体相关机制有待进一步研究。

乳腺肿瘤;外周血;单个核细胞;多药耐药相关蛋白

乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一，当前其发病率有明显增长的趋势，现已跃居全球女性发病率排行之榜首，占全身恶性肿瘤7%～10%。目前仍以手术切除加化疗为主要的治疗手段，从而降低术后局部复发或者远处转移的风险。但由于肿瘤多药耐药性(multidurg resistance，MDR)的产生，导致乳腺癌患者复发率高，化疗的疗效欠佳。肿瘤多药耐药的机制涉及多个因素［1］，其中能降低胞浆或胞核中毒性药物浓度的ABC(ATP binding cassette，ABC)转运蛋白家族备受研究者关注。ABC转运蛋白全称为ATP结合盒膜转运蛋白，是膜转运蛋白家族中的一类特殊蛋白［2.3］，其能与ATP结合并水解释放能量。这些跨膜转运蛋白能够介导多种底物分子(糖类、氨基酸、金属离子、小分子肽、蛋白以及疏水性化合物)在细胞内外的运输［4］。ABC转运蛋白家族中有10种与耐药密切相关的基因［5，6］。这10种基因有可能是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的重要防御机制。因此，逆转MDR成为肿瘤研究中的重要课题。研究表明，在正常组织和肿瘤组织中均有MRP的存在［7，8］，但是对MRP在骨髓和外周血中分布情况，鲜有报道。本课题以健康人和乳腺癌患者外周血单个核细胞为研究对象，运用荧光实时定量PCR技术和蛋白免疫印迹法检测PBMCs中的MRP，从mRNA和蛋白水平检测多药耐药相关蛋白在PBMCs中的表达，比较它们之间的差异，从而找出可能在乳腺癌耐药中起关键作用的耐药基因，为临床治疗乳腺癌提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料观察对象为2011年4月至2012年4月石家庄市第一医院普外科门诊确诊的乳腺癌患者共50例，年龄54～81岁，平均年龄(68±8)岁;对照组20例，为本院体检中心经健康体检合格的健康人，无心、肝、肺、肾等重要脏器疾患，肝肾功能试验正常，亦无自身免疫性疾病和感染，年龄52～82岁，平均年龄(67± 7)岁。2组一般资料具有均衡性。

1.2 主要试剂及仪器设备NycoprepTM1.077A人淋巴细胞分离液(挪威Axisshield公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司);逆转录试剂盒、SYBR Green I Master(日本TOYOBO公司);测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、白介素-6(IL-6)的ELISA试剂盒、鼠抗人BCRP和MRP2/3/4/5单抗(美国eBioscience公司);蛋白酶抑制剂、去磷酸化酶抑制剂和βactin抗体(美国Sigma公司);Western blot试剂和标准Marker(美国Bio-Rad公司);实时定量PCR仪(美国ABI公司);蛋白电泳(美国Bio-Rad公司)

1.3 标本采集采集健康正常人和乳腺癌患者静脉血30 ml，采集后1 h内，吸出血清，分装Eppendorf管，置-20℃冰箱保存。另抗凝留取静脉血，以密度梯度离心法分离外周血PBMCs。

1.4 外周血提取单个核细胞将收集的约30 ml肝素抗凝的外周血用Hark’s液稀释1倍，缓慢加到NycoprepTM1.077A人淋巴细胞分离液上，2 000 r/min离心20 min，吸取中间白膜层，提取单个核细胞。

1.5 血清中促炎因子的ELISA检测收集外周血上清，TNF-α、IL-8、IL-6浓度的检测采用双抗体夹心ELISA法，具体操作根据试剂盒说明书进行。

1.6 MRP mRNA表达水平的定量分析用Trizol裂解单个核细胞提取总RNA，取1 μg总RNA在反应体积为10 μl的逆转录管中进行逆转录，5×ExScriopt buffer 2 μl，dNTP Mixture 0.5 μl，Oligo dT 0.5 μl，Ex-Scriopt RTase 0.5 μl，RNase Inhibitor 0.25 μl，RNase free water up to 10 μl。反转录条件为65℃10 min，42℃温育60 min，72℃10 min灭活逆转录酶，终止反应，-20℃保存。用Real-time PCR Master Mix kit进行定量PCR检测，包括cDNA，上下游引物，SYBR Green Real-time PCR Master Mix。按下反应体系进行:5 μl cDNA，0.3 μl上下游引物，7.5 μl SYBR Green，水补齐至15 μl。反应条件如下:95℃60 s，95℃15 s，40循环，60℃60 s。数据分析以人GAPDH表达量为参照采用△△Ct法进行相对定量分析。引物见表1。

表1 Real-time PCR检测基因引物序列

1.7 Western blot蛋白印迹用RIPA细胞裂解液裂解细胞，离心取上清液后进行蛋白定量。制备的蛋白样品进行10%SDS-PAGE电泳分离，再以400 mA恒流电转印到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再加入一抗4℃孵育过夜，次日TBS-T洗涤3次，10 min/次，加入辣根酶标记的二抗室温孵育1 h，再TBS-T洗涤3次，10 min/次，ECL化学发光剂发光检测信号。

1.8 统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人血清中细胞因子的检测采用ELISA法检测健康正常人和乳腺癌患者的外周血血清中的TNF-α、IL-8、IL-6的含量。乳腺癌患者血清中炎性因子含量明显高于健康正常组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.2 MRP mRNA在健康正常人和乳腺癌患者外周血

PBMCs中的表达水平采用实时定量PCR技术检测各组外周血PBMCs中的BCRP和MRP 2/3/4/5的mRNA的表达。各MRP及GAPDH的PCR产物熔解曲线呈单一峰，峰形状锐利，说明PCR产物特异性高，无杂带。健康人PBMCs中BCRP和MRP2-5mRNA表达很低，乳腺癌患者PBMCs中，BCRP和MRP2-5mRNA表达均高于健康人组，但BCRP和MRP5的mRNA表达要明显高于健康人组，差异有统计学意义(P＜0.05);MRP2、MRP3和MRP4的mRNA表达和健康组差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表2 人血清中细胞因子的含量ng/L，±s

表2 人血清中细胞因子的含量ng/L，±s

注:与健康人组比较，*P＜0.05

组别TNF-αIL-8IL-6健康人组(n=20)15.0±2.819±418±3乳腺癌组(n=50)24.8±5.6*45±6*31±6*

表3 Real-time PCR检测PBMCs中MRP mRNA的表达±s

表3 Real-time PCR检测PBMCs中MRP mRNA的表达±s

注:与健康人组比较，*P＜0.05

组别BCRPMRP2MRP3MRP4MRP5健康人组(n=20)0.98±0.231.87±0.130.91±0.211.93±0.181.97±0.29乳腺癌组(n=50)8.21±2.35*1.97±0.110.92±0.191.99±0.094.82±1.79*

2.3 MRP蛋白产物在健康正常人和乳腺癌患者外周血PBMCs中的表达水平采用Western blot技术检测各组外周血PBMCs中的BCRP和MRP2-5的蛋白表达水平的差异。检测结果与基因表达水平一致，乳腺癌患者PBMCs中BCRP和MRP5的灰度值分别为(1.98±0.47)和(1.86±0.51)，而健康人分别为(0.11±0.03)和(0.19±0.07)，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，提示乳腺癌患者比正常人更易对药物产生耐药性。见图1。

图1 Western blot检测PBMCs MRP蛋白的表达

3 讨论

临床肿瘤学研究已表明，炎症与癌症的发生发展密切相关，15%～20%的肿瘤是由炎症引起的［9-12］。同时，在动物实验中发现，炎症可以诱导体内药物转运蛋白表达和活性改变。炎症引发肿瘤的同时又可以使药物转运蛋白的表达和活性改变，这使得肿瘤对化疗药物产生耐药性，也是肿瘤内科治疗失败的主要原因。本研究中，运用ELISA法检测实验对象血清中的促炎因子，阐明炎症影响转运体表达及活性的是有一定的相关性。

MDR的产生涉及多个方面，多个环节及多条途径，其中主要有两方面的原因:一是ABC转运蛋白，其将胞浆或胞核中毒性药物转运到胞膜外，从而降低胞内的毒性药物浓度，二是肿瘤细胞中的化疗药物对肿瘤细胞所诱导的凋亡信号和凋亡通路的激活被抑制。过去炎症对药物转运体调节的研究重点一直是癌变的组织、细胞中MDR的分布及调节。Patrick等［7］用IL-1β、IL-6刺激HepG2后，检测到MRP1蛋白表达量和功能活性增加。Kohno等［11］研究表明LPS刺激大鼠后，Mrp1 mRNA表达水平增加，而在人单细胞源的巨噬细胞中，gp120诱导及分泌的TNF-α和IL-6与MRP1的mRNA表达无关。但关于人外周血中炎性因子对BCRP及MRP2/3/4/5调控的研究报道很少。

本研究实验数据显示乳腺癌患者PBMCs中BCRP、MRP5 mRNA和蛋白表达水平明显高于健康正常人组，也高于其他MRP。最近分子靶向治疗研究发现，炎性因子通过不同的信号通路调控各种ABC转运体的表达［13，14］。Kim等［14］发现二甲双胍可以抑制NF-κB和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)，从而下调MDR1的表达。本实验结果表明BCRP、MRP5的表达上调可能是乳腺癌患者外周血中的促炎因子与PBMCs表面的相应受体结合，激活NF-κB，其使细胞进一步释放炎性细胞因子，从而使BCRP、MRP5的表达上调，降低抗肿瘤药物的疗效。

文献报道，化疗药物可以使肿瘤细胞中RAS癌基因表达增加，其激活PI3K/AKT通路，活化的PI3K/ AKT通路激活NF-κB，产生炎性反应，释放出的细胞因子调节MRP的表达和功能活性，从而出现肿瘤细胞耐药性［15，16］。其机制可能是化疗药物在杀伤癌细胞的同时，对正常细胞也有造成一定的损伤，是其细胞结构被破坏，从而释放住一些细胞因子，这些细胞因子通过相应受体进行介导炎性反应，激活NF-κB，进一步释放细胞因子来改变MRP的表达和活性功能，其将输入的抗逆转录病毒药物从细胞中泵出，从而产生耐药效应。

综上所述，本研究分析了乳腺癌患者外周血中MRP的mRNA和蛋白表达水平的差异。实验结果显示乳腺癌患者外周血中MRP的异常表达很可能与促炎因子TNF-α、IL-8、IL-6有密切关系，但促炎因子如何影响MRP，以及通过何种信号通路调节MRP有待进一步研究。

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5Michael D，Andrey R，Rando A.The human ATP-biding cassette(ABC) transporter superfamily.Genome Res，2001，11:1156-1166.

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7Patrick T，Tamima A，Reina B.Regulation of multidrug resistance protein 1 by tumor necrosis factorαin cultured glial cells:involvement of nuclear factor-κB and c-Jun N-Terminal Kinase Signaling Pathways.Mol Pharmacol，2010，77:644-659.

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Expressions of multidrug resistanc-associated protein in peripheral blood mononuclear cells in patients with breast

cancer

LI Yiming*，LIU Yukun，LIU Jing，et al．Hebei Mechical University，Shijiazhuang 050031，China

ObjectiveTo investigate the expression of multidrug resistance-associated protein(MRP)in peripheral blood monouclear cells(PBMCs)of healthy people and patients with breast cancer，and to explore their possible roles in the pathogenesis of breast cancer.MethodsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in serum were detected by ELISA in 50 patients with breast cancer(patients group)and 20 healthy subjects(control group).After the PBMCs in both groups were extracted，the expression levels of breast cancer resistance protein(BCRP)and MRP2/3/4/5 mRNA were detected by Real-time quantitative RT-PCR and Western blotting.ResultsThe levels of TNF-α，IL-8 and IL-6 in patients group were significantly higher than those in control group(P＜0.05).The expression levels of BCRP and MRP5 mRNA were significantly increased，as compared with those in control group(P＜0.05)，however，there were no significant differences in the other kinds of MRP between two groups(P＞0.05).ConclusionThe increase of proinflammatory factors in peripheral blood of patients with breast cancer may be correlated to the expressions of BCRP and MRP5，however，the related mechanism needs to be studied further.

breast neoplasms;peripheral blood;PBMCs;MRP

R 737.9

A

1002-7386(2015)02-0176-04

2014-05-30)

10．3969/j．issn．1002－7386．2015．02．004

050031石家庄市，河北医科大学临床学院(李易明、刘钊);石家庄经济学院华信学院(刘宇琨);河北省石家庄第一医院普外一科(刘竞);河北医科大学(高璇、李文建);河北省保定市第一中心医院分院(王宏)

李文建，050017河北医科大学免疫教研室; E-mail:liwenjian969@sohu.com